鹿角蛋白提取及鹿角多肽制备和活性研究

夏广清，王 岩，张露云，臧 皓*

（1.通化师范学院长白山生物种质资源研究院，通化134002；2.通化师范学院生命科学学院，通化134002；3.通化师范学院医药学院，通化134002）

鹿角，是鹿科动物马鹿或梅花鹿已经骨化完全的角，或者将鹿茸锯掉后，第二年春天脱落下来的角基，功效广泛且实用，可活血、湿阳、补肾、强筋骨、行气[1]。鹿角多肽是从鹿角中分离得到的一类分子量在0.2kDa与10kDa之间的具有生物活性的多肽[2]。多肽由于结构比蛋白质简单，可以被细胞直接吸收利用，愈来愈受到研究者的重视[3]。目前多肽的提取主要包括超滤法、层析法、高效液相色谱法和酶解法等，酶解技术是迄今为止最为重要的生物活性多肽方法[4]。本研究以梅花鹿角为原料，采用碱溶酸沉方法对其蛋白进行提取，利用胰蛋白酶水解得到多肽，并对其抗氧化活性和对酪氨酸酶活性抑制作用进行研究，为进一步开发和利用鹿角多肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中药材鹿角购自吉林省通化市老站人参市场。

1.2 试剂

BY0258 Trypsin胰蛋白酶1∶250（合肥博美生物科技有限责任公司）；NA0332 BSA V牛血清白蛋白 （合肥博美生物科技有限责任公司）；ST6700 TPTZ（合肥博美生物科技有限责任公司）；KC0615 Coomassie brilliant Blue G-250（合肥博美生物科技有限责任公司）。

1.3 仪器与设备

Bio Tek Epoch全波长酶标仪（上海菲特科学器材有限公司）；ZW-A微量振荡器 （金坛区白塔新宝仪器厂）；FA2204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；紫外分光光度计T6型（北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 实验方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 鹿角蛋白提取

称取鹿角100g，用手提式多功能药材粉碎机将原料粉碎，过120目筛，得到鹿角粉末.称取鹿角粉末20g， 分别加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mol/L的NaOH和蒸馏水，在50℃恒温水浴中加热90min，使蛋白充分溶出，冷却至室温后，5000r/min离心10min，所得上清液即为鹿角蛋白提取液。取上清液用0.6 mol/L HCL溶液调节pH值至9.5使蛋白沉淀，5000r/min离心10min，收集沉淀，调pH值至7.0，经真空冷冻干燥后，即得鹿角蛋白。

2.1.2 鹿角蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，具体方法见参考文献[5]。

2.1.3 鹿角多肽制备

取100mg/ml鹿角蛋白溶液60ml，加入1000U/g胰蛋白酶，在45℃恒温水浴下分别反应2、3、4、5和6h后，100℃条件下水浴5min，消除酶活性，每一处理重复3次。

2.1.4 鹿角多肽活性测定

采用FRAP法对得到多肽抗氧化活性进行测定，酪氨酸酶抑制活性测定参照裴世春[6]等方法进行测定。

2.2 结果与分析

2.2.1 不同浓度NaOH对鹿角蛋白提取的影响

根据参考文献[7-9]，择优选择料液比1∶10、50℃恒温水浴90min，考察不同浓度NaOH对鹿角蛋白提取影响，结果见图1。从图1可知，当氢氧化钠浓度由开始的0mol·L-1逐渐增加到1.0mol·L-1时，蛋白质含量逐渐增加，但总体增长缓慢，但当氢氧化钠浓度由1.0mol·L-1增加到1.5mol·L-1时蛋白质含量得到了极大的提高，而随着碱浓度的继续增长，蛋白质含量增加幅度不大,甚至开始下降。碱浓度在合适范围内增加可以加速鹿角蛋白从鹿角颗粒中的溶出，而过高浓度亦会破坏蛋白质表面电荷平衡，影响蛋白质分子间相互作用，使得提取液黏度加大，损失大量蛋白质，因此选择碱浓度为1.5mol·L-1时为鹿角蛋白提取的最适条件之一。

图1 不同浓度NaOH对鹿角蛋白提取影响

2.2.2 鹿角多肽FRAP活性检测

在蛋白质分解为小分子多肽的过程中，酶解时间、pH值、底物浓度、温度、加酶量均对水解度有着影响，但酶解时间对水解影响比其他几种因素大很多[10]。不同酶解时间对鹿角多肽抗氧化活性影响见表1及表2。根据不同浓度Vc对照溶液标准曲线，详见图2，得到回归方程y=4.2293x+0.0698，R2=0.9976，数值趋近于1，灵敏度高，线性条件好，可靠性强。因此可以将这条曲线作为测定FRAP抗氧化活性能力的标准曲线，该方法用作本实验评价鹿角多肽是否含有抗氧化能力以及抗氧化活性能力大小的方法。将不同时间鹿角多肽样品所测得吸光值代入回归方程可得样品中抗氧化活性物质浓度，即为抗氧化测定还原当量，详见表1，从表1可知，鹿角多肽具有一定抗氧化能力，且酶解4h时，抗氧化能力最强。

图2 Vc标准曲线

表1 鹿角多肽抗氧化活性FRAP测定

表2 鹿角蛋白不同酶解时间抗氧化活性

2.3 鹿角多肽对酪氨酸抑制酶活性影响

酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，抑制酪氨酸酶活性在一定程度上可减少黑色素的合成，阻止色素沉着从而达到美白作用。利用体外酶活性检测方法对胰蛋白酶酶解时间得到鹿角多肽活性进行分析，鹿角多肽对酪氨酸酶有一定的抑制作用，详见表2，且质量浓度在50～200μg·mL-1时，对酪氨酸酶的抑制作用呈一定的剂量效关系，随质量浓度的增加，其对酪氨酸酶活性的抑制作用增强，最高抑制率可达131.78酪氨酸UmoL·L-1，说明鹿角多肽具有良好的美白效果.此结果可为利用鹿角多肽开发化妆品提供基础性试验数据.

表2 鹿角多肽对酪氨酸酶抑制活性研究

3 讨论

研究表明，多肽影响着生物体内许多重要的生理功能，目前已知有100多种内源性生物活性肽参与人体多种生理功能，包括生命活动中的细胞生长、细胞代谢、细胞分化、激素地质调节、肿瘤病变改善、免疫调节、新陈代谢及内分泌调节等生理活动。此外，多肽还具有抵抗细菌和病毒、提高免疫能力、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、抗衰老等。由于生物活性肽具备非常好的生理活性与调节功能，于是成为了现代科研人员的重点研究对象。但是伴随着生物活性肽在现代保健医疗中广泛应用，如何制备高产率、高活性的生物活性肽成为一大生物难题。

本研究采用碱溶酸成法对鹿角蛋白进行提取，并利用胰蛋白酶对所得鹿角蛋白进行水解得到多肽，抗氧化和酪氨酸水解酶活性实验结果表明，利用1.5moL·L-1NaOH在pH8.5时，蛋白提取率最高，达0.3913mg/g，1∶2500胰蛋白酶水解4h得到多肽活性抗氧化活性较高，并且表现出一定的酪氨酸酶抑制活性。

近年来，多肽作为治疗药物已越来越受到关注。超过60只多肽药物已经获得批准上市，并使患者受益，同时还有几百个新的治疗肽处于临床前和临床开发中。多肽药物具有巨大的商业价值。本研究通过考察鹿角多肽抗氧化及对酪氨酸酶活性抑制的影响，为鹿角多肽进一步的开发应用奠定了基础。未来，我们将继续建立在天然肽的优势上，扩大肽的适用范围。