融合数据挖掘与网络药理学研究治疗原发性肝癌中药处方用药规律

潘树茂，章新友*，张玉娇，牛晓录，吴地尧，李秀云，丁 亮

(1. 江西中医药大学药学院，南昌 330004； 2. 江西中医药大学计算机学院，南昌 330004)

肝癌是中国常见恶性肿瘤之一，以原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)为主[1]。长期的中医临床实践，为中医诊疗肝癌积累了丰富的经验，并留有大量的中药方剂信息[2]。

随着信息技术的发展，数据挖掘技术在方剂配伍分析的运用日益成熟。常用的数据挖掘方法有关联规则、回归分析、决策树、聚类分析、频次分析和人工神经网络等[3]。通过数据挖掘得出中药的组方规律，为对中医方剂配伍的研究提供参考。例如，荣震等[4]对荣远明教授治疗原发性肝癌的思路进行数据挖掘，发现荣远明教授治法以“调肝理脾”为核心，辅治以“活血化瘀、清热解毒、利水消肿、消食化滞”之法。网络药理学能从多成分、多靶点、多通路角度探索药物治疗疾病的作用机制，研究思路与中医整体性、系统性的思想不谋而合[5]。例如，周玟等[6]基于网络药理学探讨葛根治疗肝癌的分子机制，发现葛根素可通过阻断PTEN/Akt/GSK3β细胞信号转导通路治疗肝癌。

由于以往缺乏信息技术与网络药理学的融合，人们多数集中于对肝癌病因的研究和诊疗经验的总结。迄今为止，缺乏对中医治疗原发性肝癌方剂用药规律及其作用机制的深入研究。因此，现融合数据挖掘和网络药理学的方法，探究中医治疗原发性肝癌的中药处方用药规律，并从网络药理学角度分析其潜在的作用机制。并遵循中医整体观的思维方式，直观地说明中药多系统调控的作用机理，从西医学靶点-疾病角度阐释方证的关联，旨在架起中、西医学融合的桥梁，为中医治疗疾病的用药规律和作用机制的研究开辟新径。

1 材料与方法

1.1 处方来源和处方筛选标准

在南昌市3个区的3所省级三甲医院中，筛选临床治疗原发性肝癌的有效中药处方(剔除无效处方，即临床诊断与用药不符的处方；剔除相同处方，即排除同一医生或同一科室的经验用方)，得到有效的中药处方共211个，并以此建立原发性肝癌处方数据库(prescription database of primary hepatic carcinoma，PDOPHC)。

1.2 处方的录入与核对

中药存在同药异名的情况，故在录入系统前，先将PDOPHC中的中药名称规范化处理，例如：将“田七”规范为“三七”、“元参”规范为“玄参”，再将规范化后PDOPHC中的中药处方数据导入中医传承辅助系统中。为确保中药名称输入的准确性，数据审核与导入由两人独立进行，并对审核与录入的数据进行校对，确保数据无误。

1.3 数据分析

通过中医传承辅助系统[4]中的“方剂分析”功能，设置适当的置信度与支持度等参数，挖掘PDOPHC中的药物使用频次、常用药对以及核心药物组合(强关联性的药物组合和聚类分析的药物组合)。

1.4 收集药物化学成分

对于得到的核心药物组合，选取置信度和频次均高的鸡内金，半枝莲，茯苓，白术(简称JBFB)进行研究。白术、茯苓常一起配伍，以健脾补虚，其中白术多糖、茯苓多糖具有抗肿瘤、增强免疫、消炎等作用[7]。半枝莲清热解毒、活血化瘀、利尿，临床上广泛用于抗肿瘤的治疗，半枝莲黄酮、半枝莲多糖、半枝莲二萜、半枝莲卟啉均有明确的抗肿瘤作用[8-10]。鸡内金主含蛋白质、氨基酸及多种微量元素，有健脾消食、固精止遗、化坚消石之效[11]，张锡纯常使用鸡内金、白术相配伍治疗脾虚、癥瘕积聚等。四药联用，符合临床用药规律，为其网络药理学的研究提供了依据。

以鸡内金、茯苓、半枝莲、白术为关键词，通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)获取四味中药所含化学成分。以口服生物利用度(oralbioavilability，OB)和类药性(drug-like，DL)作为筛选活性成分的重要指标，OB和DL越高，其开发利用程度越高，故以OB≥30%和DL≥0.18为条件进行，得到活性成分[12]。

1.5 构建成分对应靶标和PHC相关靶标库

双途径获取鸡内金、茯苓、半枝莲、白术活性成分的作用靶点。一方面，通过TCMSP数据库获得，将获取的活性成分的作用靶点名称输入到UniProt数据库，获得其靶点的人源靶点名称；另一方面，通过TCMSP数据库筛选得到的活性成分，将其输入到Swiss TargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)，预测药物靶点。最后将两者获得的靶点汇总整理。

在人类疾病数据库(MalaCards)(https://www.malacards.org/)、CTD数据库(http://ctdbase.org/)、TTD数据库(http://biddnus.edu.sg)、Pharm GKB数据库(http://www.pharmgkb.org)中，将关键词设置为“liver cancer”进行检索，对结果筛选、去重、整理。即为PHC疾病靶标数据库。

1.6 构建“活性成分-靶标”网络图

整理JBFB的活性成分及其作用靶点，输入Cytoscape3.6.1软件，构建活性成分-靶点的网络图。

1.7 构建蛋白互作网络图

将JBFB成分对应的靶标库与PHC相关靶标库导入String在线分析平台(https://string-db.org/)，分别进行蛋白与蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)，取两者的共同靶点，筛选得到与成分、PHC均直接相关的靶点为一般靶点。在Cytoscape3.6.1软件上，采用CytoNCA插件对一般靶点进行拓扑参数分析和筛选，通过介度中心性(betweeness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、度中心性(degree centrality，DC)和特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)4个参数来评价一般靶点，筛选标准为DC大于2倍中位数、BC、CC及EC分别大于1倍中位数。在一般靶标中筛选得到核心靶标，将得到的核心靶点导入DisGeNET数据库中(https://www.disgenet.org/)，以获得靶点的类型信息。

1.8 分子对接验证

利用RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载核心靶点TP53(PDB ID：5AB9)、AKT1(PDB ID：3CQW)[13]的3D结构文件，并且通过Discovery Studio 4.5 Client剔除其中的配体化合物，保留其蛋白结构。根据度值排名，取排名靠前的化合物，在TCMSP数据库下载其3D结构文件。将二者共同导入CB-DOCK(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)在线平台进行分子对接验证。CB-DOCK网站[14]通过执行AutoDock Vina(1.1.2 版本)进行分子对接，进而预测给定蛋白和配体的结合位点。Vina 得分是Vina程序对受体和配体结合程度的评分，得分越低，说明受体和配体的亲和力越高。

1.9 Gene ontology(GO)生物功能过程和KEGG代谢通路富集

将JBFB治疗PHC的一般靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中，进行基因本体(GO)分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，设定阈值P≤0.01，筛选出具有显著性差异的富集结果。同时引入Reactome数据库对筛选到的通路加以分析。结合上述结果以探究JBFB治疗PHC可能的作用机制。

2 结果与分析

2.1 用药频次分析

通过中医传承辅助平台对PDOPHC进行“频次统计”，得到344味中药，其结果按照从高到低的顺序排列。使用频次≥10的药物有86味，如表 1所示。

表 1 使用频次≥10的药物Table1 TCM with frequency ≥10 in the PDOPHC

对高频药物进行分析，发现出现频率较高的有清热药(夏枯草、白花蛇舌草、黄连等)、补虚药(白术、鳖甲、枸杞子)、利水渗湿药(茯苓、泽泻、茵陈等)、活血化瘀药(莪术、三棱、丹参等)、理气药(陈皮、香附、预知子等)。对344味中药的性味归经的研究分别从以下几方面展开讨论。首先对药味进行分析，发现甘、苦、辛味的药居多，中医治疗原发性肝癌多用补虚药和清热药，甘“能补能和能缓”，补虚药中甘味药多见，苦“能泄能燥能坚”，清热药中苦味药多见，由此可见，药味的占比排名和其功效一致性较强。然后对药性进行分析，发现总体用药比较温和，并无大寒、大热之偏性用药。其次对归经进行分析，发现归脾、肝、胃、肾经的居多，另外肺经所占比例亦较大，一般来说，中医治疗原发性肝癌多从肝、脾、肾入手，但根据五行生克理论，亦有“肺常不足，肝常有余”“怒伤肝，悲胜怒”之说，所以临床常用补肺之法增强肺金的克制力量，同时配合清肝、泻肝、疏肝等方法来平衡肝木的被克制力量，进而达到五行的动态平衡。这种肝病从肺论治的手段也体现了中医的整体观念，为中医治疗原发性肝癌提供了一个新的思路。故临床常采用以甘、辛、苦和性温的药为主，从肝、脾、肺、肾等经共同论治。

2.2 基于关联规则的方剂组方规律分析

应用关联规则挖掘方法，将支持度个数设置为“26”，置信度≥0.6，共挖掘出239组常用药对，取其中支持度个数≥50，共得到23组，这23组常用药对均由高频次的中药组成，其中白术-茯苓药对出现98次，频次最高，支持度排列方式，如表 2所示。分析药物组合的使用规律，得到486个药物组合规则，取其中置信度≥0.95，共得到24组，结果如表 3所示。

表 2 原发性肝癌处方中常用药对Table2 Commonly used TCM pairs in the PDOPH

表 3 基于关联规则的原发性肝癌处方中的药物组合Table3 Association rules on TCM in the PDOPHC

以支持度和置信度来看，药物组合均具有强相关性。结合支持度和置信度进行分析，发现大多是补虚药和利水渗湿药、清热药、化痰止咳平喘药、利湿退黄药、理气药等药物相配物。肝癌患者大多正气虚弱，中医各个医家治标之法不尽相同，但是治本之法都是一样的，均采用补虚之法以扶正固本。

结果中多是柴芍六君子汤(柴胡、白芍、人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏)的加减应用，与临床治疗相符。方中人参、白术、茯苓、甘草乃四君子汤之组方，具有益气健脾之效；陈皮、半夏具有燥湿化痰之效；柴胡、白芍一散一收，具有疏肝柔肝之效。以上补虚药与理气药、利水渗湿药等药物相互配伍，体现了中医“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的思想[15]。

2.3 基于复杂系统熵聚类的方剂组方规律分析

基于复杂系统熵聚类算法，将相关度设置为“7”，惩罚度设置为“1”，得到36个药物组合，结果如表 4所示。

表 4 基于聚类分析的原发性肝癌处方中的药物组合Table4 The key TCM combination in the PDOPHC

分析结果表明，主要是以补虚药，清热药、活血化瘀药为核心的药物，临床善于使用补虚药、清热药、活血化瘀药为主来治疗原发性肝癌，故结果与临床用药相符合。以“莪术、三棱、铁树叶”为例，莪术、三棱，常在临床上一起配伍，以加强其破血行气的作用。莪术中含有的莪术醇、β-榄香烯、姜黄素具有抗肿瘤的作用，它们通过细胞毒作用、抑制肿瘤细胞增殖等多途径发挥抗癌作用[16-17]。莪术、三棱提取液与白介素-6联用可促进人乳腺癌细胞的凋亡，其诱导凋亡的作用比单独用药更强[18]。铁树叶，有理气活血、化瘀消肿之效，其含有的铁树素和新铁树素甲乙，有一定的抗癌作用，朱晏伟等[19]发现铁树叶有促进细胞早期凋亡的作用。

2.4 药物化学成分的筛选

通过TCMSP数据库对JBFB中4味中药化学成分及其ADME参数进行检索，得到化学成分。以OB≥30%和DL≥0.18为指标对JBFB入血活性成分进行初步筛选，同时纳入不符合OB、DL，但有药理作用的化学成分，共得到57个生物活性成分。

2.5 PHC相关靶点的筛选

在MALAcards、CTD、pharm GKB、TTD数据库中检索与PHC相关的靶点，分别得到427、504、7、32个，汇总删重，共得到882个。

2.6 治疗PHC的JBFB成分的靶点筛选和分析

经TCMSP数据库、String数据库筛选，共获得JBFB对应靶点698个，PHC相关靶点882个，分别作 PPI
图，并且在“成分-靶点”网络图的基础上与“疾病-靶点”网络图进行交互处理，得到JBFB治疗PHC的124个一般靶点，如图 1所示。对JBFB治疗PHC的一般靶点进行拓扑参数分析，DC、BC、CC、EC的中位数值分别为16、27.596、0.481、0.495。选择DC>32、BC>27.596、CC>0.481、EC>0.495，得到16个核心靶点，将靶点导入DisGeNET数据库中(https://www.disgenet.org/)，获得靶点的类型信息，结果如表 5所示。

图 1 JBFB活性成分-靶点网络及JBFB治疗HPC的一般靶点Fig.1 Bioactive components-targets network of JBFB and general tagets for ingredients of JBFB for treatment of PHC

表 5 JBFB治疗HPC的核心靶点Table5 Key targets about JBFB treatment for PHC

表 6 JBFB相关化学成分对接结果Table6 Molecular docking results of active components of JBFB

通过对核心靶点的功能进行分析：TP53、AKT1、MAPK1、MAPK3、STAT3、MYC、CASP3、MAPK8、JUN主要涉及细胞的转录调控及凋亡；CCND1、PTEN主要涉及细胞周期的调控。EGF、EGFR、VEGFA主要涉及血管生成。IL6、TNF主要涉及炎症反应的调控。说明JBFB主要是通过诱导凋亡、阻滞周期，抗血管生成、调控炎症的途径来完成治疗PHC。

2.7 分子对接验证和分析

通过度值对化合物进行筛选，选取排名前七的化合物。同时选取核心靶点中的前两个靶点。对两者进行分子对接，对接结果详见表 6。结果显示，配体和受体之间均具有良好的亲和力。其中熊果酸与受体蛋白的评分最高，其对接模式如图 2所示。

参与对接的化合物大都具有抗癌活性。Casella等[20]发现，槲皮素可通过调控CCND1等多个基因，使G1期细胞数减少，从而使癌细胞的分裂周期停滞于G2/M期，达到预防肝癌发生的效果。Luo等[21]发现，槲皮素处理人肝癌细胞Hep G2后，可通过p53/mi R-34a(微小核糖核酸-34a)/SIRT1(沉默信息调节因子1)通路促进细胞凋亡。田新宇等[22]发现木犀草素和芹菜素均具有一定的抗癌活性。芹菜素经过甲醚化和溴化之后，其抗癌效价远高于先导物芹菜素、氟尿嘧啶，具有一定的研究价值[23]。熊果酸具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤侵袭等作用。虞燕霞等[24]发现熊果酸可通过上调p53基因，引起下游基因Fas[肿瘤坏死因子(TNF)受体超族，成员6]上调，在上下游基因的联合作用下使肝癌细胞SMMC-7721凋亡。黄芩素具有阻断肝癌细胞的细胞周期、诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞扩散等作用。王方[25]发现黄芩素对人肝癌细胞Hep G2生长具有抑制作用，其机制与增强含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，8，9的活性，增加丙二醛含量，减弱超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性有关。Yu等[26]发现鼠李秦素可以显著抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的VEGFR2磷酸化和下游信号转导途径的激活，减轻肿瘤组织中的磷酸化的MAPK、AKT(蛋白激酶B)和STAT3的表达，以达到抗肿瘤血管生成之效。尚未发现有苏荠苧黄酮抗癌的研究，但Chao等[27]发现苏荠苧黄酮可明显抑制脂多糖/γ-干扰素刺激的RAW-264.7巨噬细胞的NF-кB(核因子κB)转录活性，显著降低细胞分泌的TNF-α、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白-2和一氧化氮。炎症被认为是影响癌细胞生长的一个重要因素，因此推测苏荠苧黄酮抑制NF-кB的转录活性，降低癌细胞的增殖和侵袭能力。以上说明JBFB治疗肝癌在微观层次上具有合理性，同时也间接说明网络药理学的准确性与合理性。

2.8 JBFB治疗PHC的核心通路筛选和分析

通过DAVID平台对一般靶点进行GO分析和KEGG通路富集，其中基因本体分析涉及的生物过程有450个，细胞组分有38个，分子功能有48个，部分结果如图 3所示。KEGG通路富集共得到44条，如图 4所示。同时将Reactome 数据库(https://reactome.org/)与GO分析和KEGG通路结合分析，实现JBFB治疗PHC的活性成分的核心通路的筛选及注释，Reactome中JBFB治疗PHC的生物功能分析，如图 5所示。

图 2 熊果酸与TP53、AKT1的分子对接模式Fig.2 Docking mode of ursolic acid with TP53 and AKT1

图 3 JBFB治疗PHC一般靶点的GO分析Fig.3 GO analysis of general targets for JBFB for treatment of PHC

图 4 JBFB治疗PHC一般靶点的KEGG 富集气泡图Fig.4 Bubble diagram of KEGG enrichment of general targets for JBFB for treatment of PHC

图 5 用于治疗 PHC 的JBFB活性成分一般靶点的生物功能分析Fig.5 Biological function analysis of general targets for active ingredients of JBFB for treatment of PHC

结合图 3和图 5，发现JBFB的作用靶点主要涉及细胞编程性死亡、细胞周期、免疫系统、信号转导、疾病等多个生物过程；细胞组分主要涉及胞浆、细胞器腔、核质、膜封闭腔、核腔、主轴等方面。分子功能主要涉及酶结合、蛋白激酶活性、ATP结合、激酶结合、DNA结合等方面。图 4显示了JBFB作用靶点的Pathway分析结果，124个一般靶点主要分布在癌症通路、胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞白血病、大肠癌、膀胱癌、胶质瘤、小细胞肺癌、VEGF信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT(Janus酪氨酸蛋白激酶-信号传导和转录激活因子)信号通路、Toll样受体信号通路等多条信号通路中。这体现出JBFB通过调控多个复杂的生物过程、信号通路来治疗PHC，且彼此之间存在复杂的相互作用关系。这与中医治疗疾病的整体观思想不谋而合。

张妮娜等[28]发现半枝莲可以通过调控VEGF信号通路影响血管内皮细胞增殖、生长、转移以及血管通透性的增加，抑制血管的生成，进而抑制肿瘤的增殖和转移。汪雯[29]发现白术内酯类I以浓度依赖于TLR4(Toll样受体4)/MyD88(髓样分化蛋白88)下调癌细胞VEGF的表达，其高浓度还可直接抑制癌细胞分泌VEGF。李晓芸等[30]发现，半枝莲总黄酮能够抑制MAPK信号通路中JNK/SAPK(c-Jun氨基末端激酶)的磷酸化水平，并能降低细胞因子IL-6、IL-1β的含量。Yang等[31]发现半枝莲中提取的野黄芩苷能通过p53信号通路抑制癌细胞增殖，诱导其凋亡。于汝通等[32]发现黄芩素可通过失活JAK/STAT信号通路，抑制癌细胞的迁移侵袭。Li等[33]发现槲皮素可下调HMGB1(高迁移率族蛋白B1)TLR2 TLR4/NF-κB信号传导途径减轻四氯化碳所致大鼠肝纤维化。Shi等[34]发现绿原酸通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善了由四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。除此之外，还有多条信号通路为癌症，如胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、大肠癌等，表明JBFB与癌症相关性较大，而其中半枝莲广泛应用于多种癌症的治疗，这说明所得癌症类通路具有可信性。在肿瘤炎症环境中，炎性细胞可以释放化学物质，诱变周围的癌细胞，加速肿瘤的增殖和转移[35]，JBFB中的茯苓、白术和半枝莲均有抗炎疗效，推测JBFB通过影响免疫球蛋白的高亲和力受体(Fc epsilon RI)信号通路等炎症通路来改善肿瘤炎症环境，达到治疗肝癌的效果。以上研究间接佐证了所得通路的合理性。说明JBFB通过多条通路治疗PHC。

3 结论与讨论

运用数据挖掘方法，得出了治疗原发性肝癌的药物频次、性味归经和药物组合模式，从而发现临床上常采用以甘、辛、苦和性温的药为主，从肝、脾、肺和肾等经络共同论治。在中药治疗原发性肝癌处方配伍上，以补虚，清热为主，兼顾活血、理气等，总体用药规律可归纳为清补结合、虚实兼顾。研究结果表明，临床用药遵循“扶正祛邪、标本兼治”的治疗原则。

通过网络药理学对核心药物组合JBFB研究，得出了JBFB治疗原发性肝癌的核心靶点及信号通路。发现JBFB主要通过细胞凋亡、细胞增殖、血管生成、炎症等途径治疗原发性肝癌。研究结果表明，JBFB基于多成分、多靶点、多通路治疗原发性肝癌，为后续研究提供了科学依据。

有关文献实验研究表明[22，36-38]，半枝莲总黄酮显著抑制人肝癌细胞Hep3B的增殖，茯苓三萜可诱导Hep G2细胞凋亡，茯苓乙酸乙酯部位显著抑制Hep G2细胞增殖，白术挥发油能抑制人H22肝癌细胞的增殖、转移。其中，剔除广泛信号通路，应重视p53信号通路，实验研究表明，槲皮素处理人肝癌细胞Hep G2后，可通过p53/mi R-34a/SIRT1通路促进细胞凋亡[21]。熊果酸可通过上调p53基因，引起下游基因Fas上调，在上下游基因的联合作用下使肝癌细胞SMMC-7721凋亡[24]。野黄芩苷能通过p53信号通路抑制肝癌细胞增殖，诱导其凋亡[31]。以上成分均可作用到p53靶点基因，调控p53信号通路，进而抑制肝癌细胞增殖，诱导其凋亡。上述实验研究结果，进一步表明了本研究所得到的p53信号通路的可信性。

研究融合数据挖掘与网络药理学方法，从整体上分析中药治疗原发性肝癌的用药规律，若结合疾病证型和用药剂量，可更加深入地理解中药治疗原发性肝癌的组方规律。针对JBFB中药物与药物之间的用药比例，以探寻最佳用药比例，将在后续工作中进行研究。

综上所述，由于中药成分的多样性以及中药与人体的相互作用的复杂性，所以阐述中药的作用机制仍是一个难题，未能科学揭示中药分子的作用机制已成为中医现代化和国际化的瓶颈。融合数据挖掘和网络药理学方法，从中医整体观的角度分析临床治疗疾病中药组方规律，并运用网络药理学构建“药物-靶标-疾病”关系，从而分析中药复方的作用机制，将成为中药复方作用机制研究的新途径。