“SH6”苹果矮化中间砧SnRK2基因的克隆及生物信息学分析

晁琳珂 王恩莹 李鸽 郝素晓 赵艺清 卢艳芬 姚允聪

摘要 [目的]研究SnRK2基因在调控非生物胁迫方面的生物学功能。[方法]从苹果矮化中间砧“SH6”中分离得到3种SnRK2基因，运用多种生物学工具分析其序列特征。[结果]序列分析表明，SnRK2的CDS序列长度：SnRK2.6为956 bp，SnRK2.7为1 013 bp，SnRK2.8为1 072 bp，分别编码318、337和357个氨基酸的蛋白质;SnRK2蛋白无明显的疏水性，主要定位于细胞质;3种SnRK2序列相似性较高，都具有PKc_like超级家族和S_TKc家族特有的结构。[结论]这3种SnRK2基因可能在苹果非生物胁迫方面发挥重要作用。

关键词 “SH6”;SnRK2;非生物胁迫;基因克隆;序列分析

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）09-0098-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.025

Abstract [Objective] To study the biological function of SnRK2  in regulating abiotic stress. [Method] Three SnRK2 genes were isolated from the “SH6” dwarf interstock of Malus， and their sequence characteristics were analyzed by various biological tools. [Result] The sequence analysis showed that the sequence length of SnRK2 was SnRK2.6 956 bp， SnRK2.7 1013 bp， SnRK2.8 1072 bp， encoding 318， 337 and 357 amino acids respectively;SnRK2 protein had no obvious hydrophobicity， and mainly located in the cytoplasm;three SnRK2 sequences had high similarity， and all had PKc_like super family and S_TKc family unique structures. [Conclusion] Three SnRK2 genes could play important role in abiotic stress of Malus.

Key words “SH6”;SnRK2;Abiotic stress;Gene cloning;Sequence analysis

蔗糖非酵解型蛋白激酶（sucrose non-fermenting1-related protein kinase，SnRK）是植物糖信号传导、胁迫、种子萌发和幼苗生长的关键开关，广泛分布于植物体内的蛋白激酶[1]，属 Ser/Thr 类蛋白激酶，参与多种信号传导途径，对植物的抗逆境生理起到至关重要的作用[2]。SnRK1亚家族第1个报道的植物SNF1相关序列是RKIN1，一个从黑麦胚乳cDNA文庫中分离出来的cDNA[3]。RKIN1编码一个含502个氨基酸残基（57710 DA）的蛋白，与SNF1和AMPK的氨基酸序列同源性为48%。RKIN1蛋白激酶的结构域结构也类似于SNF1和AMPK，其催化结构域在N端半端[4]。另外，从拟南芥中克隆出10个SnRK2（SnRK2.1～ SnRK2.10）成员，5个受ABA诱导，9个受NaCl胁迫诱导，所有成员均不受低温诱导[5]。有研究表明，在水稻中，10个SnRK2成员（SAPK1～SAPK10）不同程度响应渗透胁迫应答，其中3个成员响应ABA胁迫诱导[6]。在大豆中发现4个SnRK2成员，GmSPK1、 GmSPK2、GmSPK3 、GmSPK4都受高渗胁迫诱导，其中SPK3还响应外源ABA处理[7]。之后相继从玉米中发现11个SnRK2基因家族成员，其中2个受NaCl诱导，2个受低温诱导，3个在转录水平受热处理被抑制[8]。苹果SnRK2基因家族鉴定出12个SnRK2蛋白序列。作为植物独有的一类蛋白激酶，SnRK2 家族成员与植物抗性密切相关，提高植物抗性的主要原因是SnRK2基因的过量表达，启动了下游一系列与抗性相关基因的大量表达[9]。

“SH6”（Malus sp.SH6）是山西省果树研究所将“武乡海棠”和“国光”的杂交后代经选育得到的经济性状和综合抗性都较为优秀的苹果中半矮化中间砧木品种，其本身抗旱、抗冻、抗抽条，嫁接亲和能力强，适用范围广，利用其作为砧木的果树树势缓和，主栽于山西、河北、北京等北方地区。目前，利用矮化中间砧是达到矮化密植栽培的主要途径，而干旱、盐害等环境胁迫均有可能造成其作为中间砧木生理功能正常发挥的障碍，因此了解SnRK2基因调控下半矮化中间砧“SH6”在非生物胁迫方面的变化，对于进一步提高其抗逆性，优化产量与品质具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

以苹果属植物“SH6”（Malus sp.SH6）为试材，自山西省农业科学院果树研究所（太谷）（112.51°E，37.35°N）采样，选取植物叶片进行试验。采样后迅速放入液氮中，之后于-80 ℃冻存。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果属植物SnRK2的克隆。

RNA的提取：称取0.1 g冻存于-80 ℃的植物叶片，参考EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱，中国）进行叶片总RNA提取。

第1链cDNA的合成：利用cDNA合成试剂盒（Takara，日本）将提取的植物叶片总RNA反转录生成cDNA。

引物的设计与合成：根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）公布的苹果同源基因MdSnRK2.6（GenBank：AII82270）、MdSnRK2.7（GenBank：AII82271）、MdSnRK2.8（GenBank：AII82272），利用NCBI Primer Designing Tool工具设计引物，序列见表1。

PCR反应扩增体系（50 μL）：水，22 μL;2×EASYPfu PCR SuperMix（全式金，北京），25 μL;SnRK2-F（10 μmol/L），1 μL;SnRK2-R（10 μmol/L），1 μL;新合成的cDNA，1 μL。

PCR反应扩增体系与条件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 4.5 min，35个循环;72 ℃ 7 min;4 ℃ 保存。

PCR产物纯化回收后，连接pEASY-Blunt Cloning Vector（全式金，北京）并转化入大肠杆菌Trans T1感受态细胞（全式金，北京），进行转化子鉴定后，选取5个阳性克隆进行测序。

1.2.2 SnRK2的生物信息學分析。

利用Compute PI/Mw计算基因的理化性质，如等电点和分子质量等信息;利用ProtScale预测其蛋白质的疏水性功能;利用SWISS-MODEL预测其蛋白质三级结构;利用NCBI Conserved Domain Search Service 分析其蛋白质保守功能域;利用MEME工具对其蛋白质序列进行保守基序分析;利用DNAMAN 7.0对检索到的相关基因的氨基酸序列进行相似性分析;利用MEGA 5.05工具进行系统进化树的构建。

1.2.3 干旱胁迫下苹果属SnRK2基因的表达分析。

在“SH6”组培苗正常生长至3叶期，对其进行干旱处理。干旱处理：正常的MS培养基中，加入10% PEG 6000模拟干旱环境。处理后20 d取样，用于基因表达分析。使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取苹果属植物“SH6”叶片的RNA，反转录合成cDNA，使用CFX96TM Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR试验，反应体系为 2×SYBR Green qPCR Mix，10 μL;Primer-F，1 μL;Primer-R，1 μL;cDNA，2 μL;ddH2O，8 μL。反应程序为95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。取3个生物学重复，并进行3次独立试验。使用2Δ-11Ct分析方法计算基因表达的差异[10]，使用Malus 18S核糖体RNA基因作为内参基因的相对定量来测定转录水平。

2 结果与分析

2.1 “SH6”植物叶片SnRK2基因的克隆

利用植物RNA快速提取试剂盒提取叶片RNA并进行质量检测，结果如图1a所示，采用同源克隆的方法，克隆得到“SH6”中3种SnRK2基因的CDS（Coding sequence）序列（图1b）。测序结果分析表明，“SH6”中SnRK2基因的CDS序列全长分别为SnRK2.6为956 bp，SnRK2.7为1 013 bp，SnRK2.8为1 072 bp，分别编码318、337和357个氨基酸。

2.2 苹果属植物“SH6”的SnRK2序列

将克隆得到的“SH6”的SnRK2基因CDS序列利用DNAMAN软件进行同源性分析（图2），结果表明，“SH6”的3种SnRK2基因SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的同源性为72.07%。

利用DNA Star SeqMan软件进行氨基酸序列分析发现，苹果属植物“SH6”中SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8分别编码318、337、357个氨基酸的蛋白质。进一步用Compute PI/Mw工具推测其氨基酸信息发现，SnRK2.6的等电点是5.48，表观分子量为38.44 kDa;SnRK2.7的等电点是6.25，表观分子量为40.21 kDa;SnRK2.8的等电点是4.73，表观分子量为40.72 kDa。用DNAMAN软件将克隆得到的3种“SH6”的SnRK2基因的核酸序列进行相似性分析（图2），发现它们核酸序列的相似性达72.07%;利用NCBI Conserved Domain Search service工具对SnRK2编码蛋白的结构域进行分析，结果表明，在“SH6”中SnRK蛋白序列N-端氨基酸区域含有S_TKc和PKc_like超级家族结构域（图3）。

2.3 SnRK2蛋白信息分析结果

利用ProtScale工具预测SnRK2蛋白质疏水性功能，SnRK2.6的平均疏水性是-0.613，SnRK2.7为-0.713，SnRK2.8为-0.748，均无明显的疏水性。通过MEME对SnRK2蛋白保守结构域分析，结果表明，3种SnRK2蛋白中各有6个高度保守的基序（图4）。利用Psort工具预测SnRK2蛋白质的亚细胞定位信息，发现SnRK2.6蛋白可能分布于过氧化物酶体（4.3%）、液泡（4.3%）、线粒体（4.3%）、质膜（4.3%）、细胞质（73.9%）、细胞核（8.7%）;SnRK2.7可能分布于线粒体（8.7%）、高尔基体（4.3%）、细胞质（52.2%）、细胞核（34.8%）;而SnRK2.8可能分布于线粒体（13.0%）、质膜（4.3%）、液泡（4.3%）、细胞质（56.5%）、细胞核（21.7%），这表明这些蛋白可能主要定位于细胞质中。进一步用SWISS-MODEL推测SnRK2的蛋白质3级结构，结果如图5所示，这些蛋白激酶主要由 α- 螺旋、 无规则卷曲、 延伸链和 β- 转角构成，与2级结构预测结果基本一致。此外，SnRK2.6蛋白激酶的3级结构与SnRK2.7 蛋白激酶极为相似，推测它们具有类似功能。

2.4 系统进化结果分析

利用MEGA 5.05软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，比对克隆得到的苹果属植物SnRK2蛋白与NCBI中检索到的18种其他物种的SnRK同源蛋白，如玉米的SnRK2.6蛋白（GenBank：ACG500100）、陆地棉的SnRK2.6蛋白（GenBank：AFH96416）、烟草的SnRK2.6蛋白（GenBank：ACQ42253）、玉米的SnRK2.7蛋白（GenBank：ACG50011）、玉米的SnRK2.8蛋白（GenBank：ACG50012）等，分析克隆所得苹果属植物蛋白与以上已知植物蛋白的同源关系。结果表明，SnRK2.6和SnRK2.7与Zm SnRK2.6（ACG50010）、Zm SnRK2.7（ACG50011）聚类在同一分支上，Sn RK2.8与Gh SnRK2.6（AFH96416）、Np SnRK2.6（ACQ42253）、Zm SnRK2.8（ACG50012）聚类在同一分支上，且与Gh SnRK2.6（AFH96416）的亲缘关系最为接近，从而推测这些蛋白具有类似功能。其余类似蛋白激酶的同源关系见图6。进化分析结果表明，3种SnRK2蛋白可能参与脱落酸信号转导途径，响应植物对干旱、高盐及低温胁等逆境的非生物胁迫。

2.5 干旱脅迫下苹果属SnRK2基因的表达

提取来自苹果属“SH6”叶片的总RNA，进行荧光定量 PCR分析，分析干旱胁迫对这些基因表达的影响。结果表明，在干旱条件下，“SH6”抗旱砧木中3种SnRK2基因的表达量普遍降低，其中SnRK2.7的表达量显著下降，证明SnRK2在干旱胁迫信号传导中发挥着重要作用（图7）。

3 讨论

（1）植物是固着生物，不能随着周围环境的变化而迁移，容易受到干旱、洪涝、冷、盐和病虫害等各种环境胁迫的侵害;而基因表达调控和蛋白质修饰是植物应对这些胁迫的2个重要途径[11]。蛋白激酶介导的磷酸化和去磷酸化过程在蛋白质修饰中起着至关重要的作用[12]。在已报道的蛋白激酶基因中，蔗糖非发酵1（SNF1）相关蛋白激酶（SnRKs）是一类Ser/Thr蛋白激酶，通过磷酸化修饰靶蛋白来调控多种信号途径的相互联系，参与不同的生理过程[13-14]。苹果作为多年生植物，其生长发育和果实产量不断受到各种环境胁迫的影响。苹果SnRK2基因家族的鉴定为基因在胁迫反应中的功能研究提供了基础，苹果中已经鉴定出12个SnRK2蛋白序列，其中MpSnRK2.1/2.8/2.9/2.10可能被ABA强烈激活，参与ABA信号的感知[15]，因此，SnRK2在干旱胁迫和ABA信号传导中发挥着重要的作用。渗透胁迫会激活植物体内的SnRK，迅速改变植物ABA激素应答基因的表达和代谢[16]，以适应不良环境。

（2）该研究结果表明，干旱处理中抗旱砧木“SH6”中SnRK2基因的表达量存在差异，从苹果属植物“SH6”叶片中提取的总cDNA中克隆到3种SnRK2基因SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的CDS，其编码区全长分别为956、1 013和1 072 bp，分别编码318、337和357个氨基酸的蛋白质。同源比对结果显示，“SH6”中3种SnRK2基因的CDS序列同源性较高，均含有PKc_like超级家族和S_TKc结构域;其蛋白质3级结构相似，且疏水性不明显，但亚细胞定位不一致。系统进化树分析显示，“SH6”中的3种SnRK2蛋白与玉米、陆地棉和烟草等植物中SnRK蛋白的亲缘关系较近，暗示它们在调控植物生长发育方面具有相似的功能。除此之外，还发现“SH6”中分离得到的3种SnRK2在以下方面存在差异：由于其序列存在27.93%的差异碱基，造成了SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的理论等电点不同，表观分子量亦然;虽然它们的保守基序基本一致，但在保守结构域上存在一些差异，这些差异可能是27.93%的碱基差异、基序差异，甚至是蛋白高级结构上的差异造成，可能会引起不同种类SnRK2基因在植物器官和组织内表达量的不同，由此造成它们在非生物胁迫方面的应激性差异。

（3）矮化中间砧品种“SH6”具有嫁接亲和力好、无“大小脚”现象、抗性强、固地性好、压条易繁殖等特点，且早果丰产，抗旱及抗黄化病能力强，品质优良，但耐盐碱力较差。该研究克隆和分析了“SH6”中的SnRK2基因，并探索了胁迫条件对SnRK2基因表达的影响，有助于加深了解SnRK家族

在植物抗逆等相关过程中的机理，为提高植物抗逆性及苹

果果实优产丰产奠定了初步的理论基础。

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