高效液相色谱法同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和芦丁

2021-06-22齐红于姗姗李敏张秋红

化学分析计量 2021年6期

齐红，于姗姗，李敏，张秋红

（济南市食品药品检验检测中心，济南 250102）

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物的干燥全草，夏、秋二季采收，具有清热解毒，利水消肿，活血止痛等功效，用于肺热咳喘，肠痈、扁桃体炎，咽喉炎，小便不利等症，外用可治疮疖痈肿和毒蛇咬伤等［1］。白花蛇舌草始载于《潮州志》，其花白色，叶似蛇舌。“茎、叶榨汁饮服，治盲肠炎，又可治一切肠病”。产于广东、香港、广西、海南、安徽、云南等省区，多见于水田、田埂和湿润的旷地［2］。白花蛇舌草为民间常用中草药，广东、广西、上海、山东和江苏等省市（自治区）的地方标准中有收载，《中国药典》2020年版一部收载了17种含白花蛇舌草的复方制剂［3］。

白花蛇舌草含有环烯醚萜类、三萜类、蒽醌类、黄酮类、有机酸类、甾醇类以及苯丙素类等活性成分［4–6］，还含有锡、锰、锌、锶、铬等微量元素［7］。现代药理研究已证实白花蛇舌草可通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用，具有免疫调节、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒［8–9］等作用。目前，白花蛇舌草质量控制研究集中在萜类成分齐墩果酸、熊果酸［10–13］和对香豆酸［14–16］的含量测定，其它成分如芦丁、槲皮素［17］、去乙酰车叶草酸甲酯［18］、6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯［19］等亦有报道，但同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和芦丁还未见报道。对香豆酸为酚酸类成分，芦丁为黄酮类成分，两者均具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用［20］。

笔者在前人研究的基础上建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和芦丁含量，该方法准确度高、分离度好、操作简单，并对12批白花蛇舌草饮片中对香豆酸和芦丁的含量进行了测定和比较，为白花蛇舌草饮片的质量控制提供了实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC–20AT型，二极管阵列检测器，LCsolution工作站，岛津企业管理（中国）有限公司。

数控超声波清洗器：KQ–600GDV型，昆山市超声仪器有限公司。

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪有限公司。

电子天平：MS204TS型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多仪器公司。

对香豆酸对照品：批号为112037–201801，以99.3%计，中国食品药品检定研究院。

芦丁对照品：批号为100080–201811，以91.7%计，中国食品药品检定研究院。

甲醇：色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司。

实验用水为纯净水。

实验用其余试剂均为分析纯。

白花蛇舌草饮片样品：均为茜草科植物白花蛇舌草，样品编号及来源见表1。

表1 样品信息

1.2 HPLC色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm，瑞典Nouryon公司）；流动相：甲醇–0.1%磷酸溶液（体积比为30∶70）；检测波长：308 nm（对香豆酸）、353 nm（芦丁）；流量：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；进样体积：10 µL。对照品溶液色谱图见图1、图2。

图1 308 nm波长下对照品溶液色谱图

图2 353 nm波长下对照品溶液色谱图

1.3 对照品溶液的制备

精密称取对香豆酸对照品10.62 mg、芦丁对照品9.09 mg，分别置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至标线，摇匀，制得对照品贮备液，取对香豆酸对照品贮备溶液1 mL、芦丁对照品贮备液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至标线，摇匀，即得，对香豆酸、芦丁质量浓度分别为10.55、41.68µg／mL。

1.4 样品溶液的制备

取白花蛇舌草粉末（过3号筛）约1.0 g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的考察

以编号为6的白花蛇舌草样品为待测对象，进行了提取溶剂、提取方法和提取时间的考察。分别选择甲醇、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液3种提取溶剂对对香豆酸和芦丁进行提取，结果表明，以甲醇为提取溶剂时，色谱峰峰面积较大，峰形较好，基线平稳，故采用甲醇为提取溶剂。

以甲醇为提取溶剂，分别采用超声法、回流法、索氏提取法对对香豆酸和芦丁进行提取，结果表明，3种提取方法的色谱峰峰面积接近，超声法操作简单，故选用超声法对样品进行提取。

考察超声时间分别为20、30、60 min时的提取效果，发现超声提取30 min时，提取较完全，故选择超声时间为40 min。

2.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器在200～400 nm波长下进行扫描，采集光谱图，对香豆酸和芦丁的光谱图分别见图3、图4。由图3、图4可见，对香豆酸在308 nm处有最大吸收，芦丁在254、353 nm下均有最大吸收，但在353 nm下芦丁的基线更平稳，因此选择对香豆酸、芦丁的检测波长分别为308、353 nm

图3 对香豆酸光谱图

图4 芦丁光谱图

2.3 色谱条件的考察

改变色谱条件对白花蛇舌草样品溶液进行分析，来考察色谱条件变化对测定结果的影响。色谱条件变化如下：

（1）对3种流动相系统进行了考察，分别为甲醇–水系统、甲醇–0.1%磷酸溶液系统和乙腈–0.1%磷酸溶液系统，试验结果发现以甲醇–0.1%磷酸溶液（体积比为30∶70）作流动相时，色谱峰的分离效果较好，且基线较为平稳。

（2）将流动相流量分别设定为0.8、1.0、1.2 mL／min，当流量设定为1.0 mL／min时，色谱峰分离效果较好，峰形较好。

（3）柱温分别设置为25、30、35 ℃，色谱峰分离效果均较好，为便于操作，柱温选择30 ℃。

（4）分别选用SHIMADZU VP–ODS C18（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）型色谱柱和Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色谱柱，色谱峰分离效果均较好。实验选择Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色谱柱。

2.4 线性方程、线性范围与检出限

用自动进样器依次吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12 µL注入色谱仪，测定峰面积。以对照品的质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。用甲醇逐级稀释对照品溶液，在1.2色谱条件下进样测定，以3倍信号和噪音（S／N）的比值对应的溶液浓度作为方法检出限。对香豆酸、芦丁的线性范围、线性方程、相关系数及检出限结果见表2。

表2 香豆酸、芦丁的回归方程和线性范围

2.5 稳定性试验

取编号为6的白花蛇舌草样品，按1.4方法制备样品溶液，分别于制备完成后第0、2、6、8、12、24 h进样测定，结果见表3。由表3可知，对香豆酸和芦丁峰面积的相对标准偏差分别为2.31%、0.91%，表明样品溶液在24 h内稳定性较好。

表3 稳定性试验结果

2.6 精密度试验

取编号为6的白花蛇舌草样品6份，每份约1.0 g，精密称定，按1.4方法制备样品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表4。

表4 精密度试验结果

由表4可知，对香豆酸和芦丁的峰面积相对标准偏差分别为1.60%、1.16%，说明该方法精密度较好，能满足测定要求。

2.7 回收试验

精密称取编号为6的白花蛇舌草样品6份，每份约0.5 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入对香豆酸对照品贮备液1 mL、芦丁对照品贮备液5 mL，按1.4项下方法制成样品溶液。在1.2色谱条件下测定，分别计算对香豆酸和芦丁的加样回收率，结果见表5。加标样品溶液色谱图见图5、图6。由表5可知，对香豆酸和芦丁平均回收率分别为94.01%、91.05%，相对标准偏差分别为1.90%、1.45%（n=6），说明该方法具有较高的准确度。