猪瘟E2灭活疫苗与活疫苗免疫效果比较

文│齐亚辉（陕西省动物卫生与屠宰管理站）

朱宝（陕西省动物疫病预防控制中心）

韩永刚（陕西省汉中市汉台区畜牧兽医技术推广中心）

冯树涛（陕西省靖边县宁条梁区域农牧工作站）

猪瘟又称经典猪瘟或古典猪瘟，是猪的一种急性、发热接触性传染病，在自然条件下只感染猪。该病流行范围很广，而且致死率极高，给世界养猪业造成严重危害。目前，猪瘟流行地区或国家主要采用接种C株弱毒疫苗的方法作为预防猪瘟的主要策略，但接种弱毒疫苗的传统预防控制方法无法区别疫苗免疫抗体和自然野毒感染抗体，为了采用血清学方法净化消灭猪瘟，新型基因标记疫苗的研究已经迫在眉睫。近些年陆续有国内外研究者应用分子生物学和基因工程方法，对猪瘟野毒株或弱毒株进行基因修饰构建出新毒株，其中以Erns（或E0）和E2为基础构建新毒株的方法占据着重要地位。有中国台湾研究者利用巴斯德毕赤酵母系统成功表达了重组猪瘟E2蛋白，并在其后的动物保护试验中获得成功。国内研究者对亚单位疫苗的研究比较深入，一个商品化的杆状病毒表达的重组E2亚单位疫苗已成功注册，并推广使用。此外，还有其他学者正在研究CHO表达E2等。

猪瘟C株活疫苗可以诱导产生针对不同强毒株和各种基因群的免疫保护，临床保护率可达100%，被行业认定为控制猪瘟的“金标准”疫苗。但是经典的C株疫苗不能区分主动免疫和自然野毒感染动物，为了完成中国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》及《国家猪瘟防治指导意见（2017—2020年）》中的到2020年年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围的要求，新型猪瘟标记疫苗将在净化、消灭猪瘟的过程中发挥重要作用。

当前，规模猪场开展猪瘟净化时，需要先成为猪瘟稳定控制场，即在进行猪瘟E2蛋白杆状病毒重组灭活疫苗免疫6～8个月后的猪群中，完全清除所有猪瘟自然野毒感染产生的E0抗体阳性的猪只。可以看出，目标猪场内进行猪瘟E2蛋白杆状病毒重组灭活疫苗免疫是创建猪瘟稳定控制场的一项必要步骤。因此，开展猪瘟病毒E2蛋白灭活疫苗及猪瘟C株活疫苗产品临床免疫效果评价，是保证猪瘟免疫效果的必要工作。

汉台区是陕西省汉中市政治、经济、文化中心，近年来随着城镇化快速发展，养殖用地逐年减少，生猪集约化饲养成为该区畜牧业发展的主攻方向。为此，开展不同猪瘟疫苗免疫效果评价，提高养殖场猪瘟防控水平，客观评估疫情压力及传播风险，为经典猪瘟防控提供技术支撑。

一、材料与方法

1.两种猪瘟疫苗免疫方法。对比试验猪场为规模养殖场，母猪存栏量540头。实行程序化免疫。

猪瘟E2灭活疫苗：母猪于2018年7月26日普免50头，免疫剂量为2毫升/头；保育猪免疫日龄30天，免疫98头，免疫剂量为2毫升/头；5号育肥圈育肥猪首次为30日龄免疫C株活疫苗，60日龄二免灭活疫苗2毫升/头，免疫50头。

猪瘟C株活疫苗（脾淋）：全场剩余母猪于2018年7月27日普免，免疫剂量为2头份/头；保育猪、育肥猪首免日龄30天，55日龄二免；5号育肥圈育肥猪首次为30日龄免疫C株活疫苗，60日龄二免猪瘟活疫苗2头份/头，免疫300头。

母猪上述猪瘟疫苗均每间隔4个月加强1次。

2.样品采集。按照总体随机抽样的方式，保育猪在75日龄进行血液样本采集；育肥猪在125日龄进行采样；母猪在10月21日（疫苗免疫后85天）进行采样。全血置室温下自然凝固，分离血清于离心管中，编号后于－20℃保存待检。本次共采集血清样本母猪20份、保育猪20份、育肥猪20份；其中，猪瘟E2灭活疫苗、猪瘟C株活疫苗（脾淋源）各10份。

3.检测方法。选用在疫苗免疫后早期抗体检测中敏感性明显高于进口阻断ELISA试剂盒，而特异性与之没有明显差异的国产猪瘟间接ELISA试剂盒，操作步骤按照试剂盒说明进行。

4.仪器设备。Sunrise酶标仪、电热恒温培养箱、普兰德移液枪（10～100微升、20～200微升）八道移液器、超纯水机、微量振荡器、量杯、200微升一次性枪头等。

5.检测试剂。猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒，由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供，有效期20190917。

6.判定标准。

（1）试验结果同时符合下列条件，方为有效：阴性对照OD450平均值应≤0.20，本试验中阴性对照OD450平均值＝（0.090+0.087）/2＝0.0885≦0.20；两孔阳性对照OD450平均值应≥0.80，本试验中阳性对照OD450平均值＝（1.45+1.387）/2＝1.4185≥0.80。均符合试验要求条件，试验有效。

（2）结果的判定。阳性：样品OD450值≥阳性对照OD450平均值×0.3，即CSFV抗体阳性。本试验阳性样品判定条件为：1.4185×0.3＝0.4256；可疑：阳性对照OD450平均值×0.3≥样品OD450值≥阳性对照OD450平均值×0.25，应再进行双孔复试，若任意孔或两孔均为阳性，则视为CSFV抗体阳性；若任意孔或两孔均为阴性，则视为CSFV抗体阴性。本试验中：1.4185×0.3＝0.4256≥样品OD450值≥1.4184×0.25＝0.3546为可疑；阴性：样品OD450值≤阳性对照OD450平均值×0.25，即CSFV抗体阴性。本试验中：样品OD450值≤1.4184×0.25＝0.3546为阴性。

7.数据处理。利用计算机统计分析软件对结果进行对比分析，检验采用卡方检验，检验水平取0.05。

二、检测结果

本次猪瘟疫苗免疫效果对比试验结果见表1。

表1 对比试验结果

三、讨论与分析

猪瘟疫苗不同生产工艺抗原含量差距较大，相应工艺之间抗原含量标示方法也有较大差异；本次选用种度代次较低的脾淋C株疫苗进行对比；活疫苗可很快诱导细胞免疫，免疫早期检测不到中和抗体的情况下，猪却能抵抗强毒的攻击，说明免疫早期细胞免疫的作用更加重要。如果接种后晚些时间攻毒，猪群中和抗体水平与攻毒保护之间呈一定相关性。张东东、宁宜宝等研究显示抗体中和检测方法（FVNT）与间接ELISA检测方法对免疫猪血清抗体由阴转阳的检出时间大致一样，而与阻断ELISA试剂盒相差较大，因此虽然本次仅对两种疫苗各阶段猪只免疫抗体的间接ELISA检测结果进行了比对研究，但比较结果仍具有一定指导意义。

对比试验中猪瘟E2灭活疫苗与猪瘟（脾淋源）疫苗母猪、育肥猪、保育猪免疫抗体效价OD值数据经两样本均数T检验分析分别为：母猪，t＝9.1283、P＜0.001（t0.001＝3.922），差异极其显著；育肥猪，t＝3.8511、P＜0.01（t0.01＝2.878），差异极显著；保育猪，T＝2.5455、P＜0.05（t0.05＝2.101），差异显著。

本次试验中猪瘟E2灭活疫苗与猪瘟（脾淋源）活疫苗免疫抗体效价OD值离散度分别为：母猪，7.08%、8.90%，差异不显著；育肥猪16.09%、25.67%，猪瘟E2灭活疫苗免疫组整齐度更好；保育猪，24.83%、18.85%，猪瘟（脾淋源）活疫苗免疫组整齐度更好。

保育猪猪瘟E2灭活疫苗抗体效价OD值离散度大于（脾淋源）活疫苗加强免疫组，原因可能是本次试验中鉴于母猪是初次免疫猪瘟E2灭活疫苗，且仔猪猪瘟E2灭活疫苗免疫受母源抗体影响较小，为保持猪场免疫程序稳定，仔猪猪瘟E2灭活疫苗免疫安排在30日龄（疫苗说明书推荐首免日龄为70日龄），根据疫苗说明书使用方法，之后未再进行加强免疫；其次断奶仔猪免疫系统发育不完全也是原因之一，因此保育猪阶段尚需要更多的试验数据进行免疫效果对比。