优化河虾中4种硝基呋喃的前处理检测方法

窦银花 田怀香 郑小平

摘要 [目的]优化河虾中4种硝基呋喃的前处理方法。[方法]以标准方法中37℃的衍生温度下衍生17.0 h为对照，优化衍生温度和衍生时间，在阴性河虾中加入酸性提取液和衍生试剂2-硝基苯甲醛。[结果]在80℃的衍生温度下衍生2.0 h，提取效率和标准方法接近，反复试验6次，相对标准偏差都小于10%，除了呋喃妥因（AHD）响应偏小，相对偏差值较大。4种硝基呋喃代谢物的检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.50 μg/kg，在标准曲线范围内线性良好，3个水平的回收率在90%～110%。[结论]该方法简单、快速、准确、可重复且灵敏，可以满足河虾中硝基呋喃残留量的监测要求。

关键词 硝基呋喃代谢物;河虾;衍生温度;衍生时间;前处理方法;优化

中图分类号 TS254.7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）02-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.051

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Pretreatment Detection Methods for Four Nitrofurans in Shrimp

DOU Yinhua1，TIAN Huaixiang2，ZHENG Xiaoping1 （1.Shanghai Bino Testing Technology Service Co.，Ltd.，Shanghai 200101;2.Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418）

Abstract [Objective] To optimize the pretreatment methods of 4 kinds of nitrofurans in river shrimp.[Method]Taking the derivatization temperature of 37℃ in the standard method for 17.0 h as the control，the derivative temperature and time were optimized.Acid extract and derivative reagent 2nitrobenzaldehyde were added to the negative shrimp.[Result] The derivative temperature was 80℃ and the derivative time was 2.0 h， the extraction efficiency was close to the standard method，and the relative standard deviation was less than 10% after 6 times of repeated experiments，except that the response of nitrofurantoin （AHD） was smaller and the relative deviation was larger.At the same time，the experiment found that the detection limit of the four nitrofuran metabolites was 0.25 μg/kg，and the limit of quantification was 0.50 μg/kg，the linearity was good in the range of standard curve，and the recoveries of three levels were between 90% and 110%.[Conclusion]The method has the advantages of simple and fast operation，accurate results，good repeatability and high sensitivity，and can meet the monitoring requirements of nitrofuran drugs in shrimp.

Key words Nitrofuran metabolites; Shrimp; Derivative temperature; Derivative time;Pretreatment method;Optimization

硝基呋喃類药物对大多数革兰氏菌、真菌和原虫等病原体均有预防和控制的作用，是一种合成型广谱抗生素，生产成本低、药效显著、耐药性差、应用广泛，大量用于河虾和畜牧业[1-3]。硝基呋喃代谢物主要包括呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）、呋喃西林（SEM），是一类带有5-硝基呋喃环结构化合物[4-5]，长期食用此类药物，会诱导有机体发生突变和癌变[6-7]。从21世纪初开始，中华人民共和国农业部公告第235号明确规定动物食品中兽药的最大残留限量，禁止在动物食品中检出硝基呋喃类兽药[8-9]。 欧盟和亚洲等许多国家也规定，硝基呋喃代谢产物在动物食品中不得检出。

截至目前，硝基呋喃代谢物的检测方法有酶联免疫吸附分析技术（ELISA）[10]、免疫胶体金技术（GICT）[11]、快速检测法-酶联免疫法[12]、光谱分析法-分光光度法[13]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[14]，其中液相色谱-串联质谱法应用最为广泛，并制定了相关方法的测定标准。该研究通过优化样品前处理方法，包括提高衍生温度、缩短衍生时间，建立了硝基呋喃代谢物的残留检测方法，并将3种不同浓度的硝基呋喃代谢物添加到河虾空白样品中，为测定河虾中的硝基呋喃代谢产物提供快速、高效和准确的方法[15]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。安捷伦1290-6470超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪（Agilent ），配备大气压电喷雾电离源（ESI）; 电子天平（梅特勒-托利多）;涡旋振荡器（TALBOYS）;高速匀浆机（FLUKO）;高温恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.2 试材。乙腈、乙酸乙酯和正己烷均为色谱纯。 盐酸、二甲基亚砜、2-硝基苯甲醛、磷酸二氢钾和氢氧化钠均为优级纯，试验前称取75.0 mg 2-硝基苯甲醛溶于5 mL 二甲亚砜中，现配现用;实验室水取自PURELAB超纯水仪。

标准品包括氨基脲（SEM）、5-甲基吗琳-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）和1-氨基-乙丙酰脲（AHD），均为德国 Dr.Ehrenstorfer 公司产品，纯度≥99%。内标物包括5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素内标物 （AMOZ-D5）、1-氨基-2-内酰脲的同位素内标物 （AHD-13C3）、3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素内标物 （AOZ-D4）、氨基脲的同位素内标物 （SEM-13C15N2），均为德国 Witega 公司产品，纯度≥99%。样品河虾购自超市。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理。

于50 mL离心管中称入2.00 g样品，加入4种硝基呋喃内标，加入10 mL萃取溶液 0.2 mol/L盐酸匀浆，加入150 μL 衍生试剂2-硝基苯甲醛，并充分振荡。在恒温干燥箱中，将温度分别设置为37、60、70、80和90℃，并将衍生时间分别设置为1、2、3、4、5和17 h，其中只有37℃时的衍生物需衍生17 h[15]。取出离心管，冷却至室温，加入适量的磷酸氢二钾，充分混合，加入15 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡2 min后，然后在-4.0 ℃时，于10 000 r/min的转速下离心 3 min 后，取出乙酸乙酯至另一个50 mL 离心管中，再重复提取一次，合并上层乙酸乙酯，在50℃下氮吹至近干，加入乙腈和水（1+9）1.0 mL复溶，过0.22 μm 滤膜上机待测。

1.2.2 标准曲线溶液的配制。

将100 ng/mL混合标准溶液分别准确地移取100、200、500 μL到3个50 mL离心管中，将10 ng/mL混合标准溶液分别准确地移取50、100、500 μL到3个50 mL离心管中，并添加50 μL、100 ng/mL的混合内标溶液到6个离心管中。同样品一起衍生，标准曲线的工作浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，内标浓度为5.0 ng/mL。

1.2.3 仪器条件。

液相条件：色谱柱为Poroshell 120（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）;流动相为乙腈和2.0 mmol/L乙酸铵甲酸水溶液（含0.1%甲酸）;进样量为5.0 μL。梯度洗脱条件如表1所示。质谱参数（ESI）：干燥气温度350℃，干燥气流量为10.0 mL/min，毛细管电压3 500 V，MRM多反应监测，具体参数见表2。

1.2.4 回收率的测定。

4种硝基呋喃代谢物设置1.0、2.0、5.0 ng/mL 3个添加水平，按照“1.2.1”方法预处理样品，通过“1.2.3”仪器条件检测，并由峰面积来定量，算出回收率和标准偏差。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化 将4种浓度为10 ng/mL的硝基呋喃代谢物于37℃恒温干燥箱中衍生17 h后进行测定，只有在较高浓度条件下优化目标药物的质谱条件，目标化合物才有较高的响应值。根据农业部783号公告-1-2006《河虾中硝基呋喃代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中给出的定量离子和定性离子，优化了传输电压和碰撞能量，确定最佳质谱条件见表2，标准工作液的质谱图见图1。

2.2 色谱条件优化 试验表明，甲酸在正离子模式下可以提高离子化效率，但峰形不对称，会拖尾，在流动相中加入乙酸铵缓冲盐，可以改善峰形，提高了化合物在C18柱上的保留效果，从而提高了化合物的响应值和灵敏度，所以水相采用2.0 mmol/L 乙酸铵甲酸水溶液（含0.1%甲酸）。试验表明，与甲醇相比，乙腈作为有机相时峰形较对称尖锐，灵敏度更高。

对各物质的峰形和响应值会产生影响的还有流速和洗脱梯度。 调整流动相的洗脱程序和改变流速，观察峰形和响应值的变化。试验表明在0.4 mL/min的流速下，使用表1中的洗脱梯度，具有理想的峰形，无拖尾和良好的对称性。4种硝基呋喃代谢物保留时间均在4 min之内（图2），且将乙腈比例调至95%，并保持1 min，将残留在色谱柱中的样品杂质冲洗干净，使得保持仪器的灵敏度，降低仪器的信噪比、保证保留时间的重现性好，再将流动相比例恢复至初始化比例，提高灵敏度，降低噪音。

2.3 前处理方法的优化

河虾中蛋白质和脂肪含量较高，衍生时加入过量的盐酸，不仅提供有利的衍生环境，还能提高水解速率，释放出脂肪中的目标物，也利于提高衍生效率。衍生试剂的量太少，衍生不完全，衍生试剂的量太多，导致浪费，添加150 μL的衍生试剂不仅可以使反应充分，还可以节省成本。加入适量的磷酸氢二钾缓冲盐，可以中和多余的盐酸，调节pH至中性偏碱，不用精确调节每个样品的酸碱度，大大提高大批量样品处理的效率。冷冻离心，取上层乙酸乙酯吹干，既可以不用有机溶剂，保护环境，也可以节约成本，提高效率。

试验研究了衍生化的时间和温度与硝基呋喃代谢物响应值之间的变化关系。以37℃恒温衍生17 h为对照，比较了其他几种温度和时间下的衍生效果，结果表明（表3），4种代谢物的响应值随着温度增加和时间延长而增大，在80℃ 下衍生2 h时的响应值和37℃下衍生17 h时的响应值接近，在80℃的衍生温度下衍生更長时间响应变化不大，或在90℃的衍生温度下衍生2 h或更长时间响应值不变或略微下降。因此，选择在80℃恒温下反应2 h作为河虾中硝基呋喃代谢物的衍生条件。

2.4 方法验证

2.4.1 方法的线性关系、检出限和定量限。根据上述“1.2.2”方法，采用内标法进行定量分析，绘制标准曲线并进行线性回归分析，结果见表4。将4种待测组分分别添加到空白试剂和阴性河虾中，信噪比（S/N）为3时计算检出限，S/N为10时计算定量限，从表4可以看出，4种硝基呋喃代谢物线性相关性较好，检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.50 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度。

向阴性的河虾中加入标准物测定回收率和精密度，样品前处理与“1.2.1”相同。加入1.0、2.0、5.0 ng/mL的含量，重复试验6次，然后计算加标回收率和RSD，结果见表5。从表5可以看出，3个水平的添加回收率在90.2%～109.2%，RSD在1.2%～7.6%。因此该方法满足4种硝基呋喃代谢物在河虾中残留量的测定。

3 结论

该试验优化了河虾中4种硝基呋喃代谢物的前处理方法。通过对衍生时间和衍生温度的优化，确定在80℃温度下衍生2 h，也能达到检测方法要求，同时确定和验证该方法的检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.50 μg/kg ，在0.50～50.00 ng/mL 范围内线性关系好，回收率高，相对标准偏差小。该方法具有快速、方便、准确、高效、回收率高、重复性好的优势，大大地缩短了前处理时间，提高工作效率，降低检验成本，又可以对河虾中4种硝基呋喃代谢物进行精准的定性和定量，满足河虾中硝基呋喃代谢物残留量的监控要求，保障食品安全，守住食品安全的最后一道防线。

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