液体活检在肺结节诊疗中的应用现状及前景

李柏钧 温昭科

【关键词】 液体活检;肺结节;游离循环肿瘤细胞;循环RNA;循环肿瘤DNA;肿瘤血小板;外泌体

中图分类号：R734.2   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.04.013

在全世界范围内，肺癌是发病率和死亡率居于第一位的恶性肿瘤，且约四分之三的病人在诊断时已处在疾病的晚期，失去了手术机会，5年存活率低[1]。随着低剂量螺旋计算机断层扫描在国内外的广泛应用，大量肺结节的患者被发现，但是肺结节并不等于肺癌，只有5%～10%的肺结节为恶性，而恶性结节如果不进行早期干预，其恶性程度强、病情进展迅速、预后差，如果能在早期对病灶进行手术切除，将会明显改善肺癌患者的预后[2]。临床上依据肺结节一般特征如大小、形态、成分比例、密度，以及特殊征象如毛刺样改变等以判别肺结节的良恶性程度。同时，对于诊断困难的患者进行定期随访[3]。然而这些策略不仅增加了患者的经济负担，而且加剧了患者的焦虑心理。因此，早期准确地定性诊断肺结节成为临床面临的主要挑战。最常用的肺结节评估手段包括痰脱落细胞学、肺部CT、支气管镜检查、肺组织活检等[4]。痰脱落细胞学具有无创、经济等优点，但阳性率非常低。肺部增强CT具有准确、快捷、敏感性较高等优点，但是具有辐射性、严格的设备要求等缺点。支气管镜检查是侵入性获得病理标本的手段，结果的敏感性较低。手术具有可获得病理标本并消除病灶的优点，但具有手术及麻醉的风险。液体活检是通过检验血液或其他体液（如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液等），协助临床对肿瘤等疾病进行诊断、判断预后、选择治疗方案的一种检测手段。具有无创、标本易获得且可重复获取、能够动态反映肿瘤基因谱全景等优点，有被广泛应用于各种肿瘤的诊断及治疗方案选择的潜力。液体活检包括游离循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体、循环RNA及肿瘤血小板（tumor educated platelets， TEPs）等多项技术。现对液体活检在肺结节定性诊断中的研究现状和应用前景进行讨论，希望可以为肺结节的定性诊断提供更多选择和更准确的方法。

1 CTC

1.1 CTC的定义

通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为CTC。CTC在肿瘤形成过程中因脱落而进入血液循环中，故而对肺结节等肺癌的早期诊断具有重要作用。CTC的优势表现有以下几点：①可通过观察CTC细胞形态确定肿瘤的恶性表型，还可以进行荧光原位杂交和免疫细胞化学等进一步检测;②可通过CTC的表型鉴定以检测基因组变化，同时进行体外培养CTC建立CTC细胞系以用于各种体外、体内的功能实验及药物筛选[5～6]。因此，CTC在肺癌的个体化治疗方面具有巨大潜力。目前，CTC检测可用的方法包括：上皮细胞因子阳性富集法和白细胞去除法、免疫荧光法、密度梯度离心法、免疫磁珠技术等。

1.2 CTC在肺结节诊疗中的应用

ILIE等[7]检测到3%的慢性阻塞性肺疾病患者外周血中含有CTC，当时肺部CT并未发现肺结节，随后监测1 至4年才发现肺结节，行手术切除后术后病理均显示均为Ⅰa期肺癌。RIED等[8]发现无症状高危因素的人群中外周血CTC阳性率为50%，其中20%的患者在后续的影像学筛查中发现了早期肺癌。这些研究表明，CTC检测可以先于影像学发现恶性肿瘤的存在。因此，我们可以推测联合CTC和影像学将提高对肺结节定性诊断的准确率。YU等[9]检测153例非小细胞肺癌患者与113例对照组患者外周血中CTC，结果发现肺癌患者外周血中CTC明显增多，其中对Ⅰ期肺癌的敏感性为67.2%。该研究说明液体活检在肺癌的诊断中是可行的生物标志物，甚至对于在肺部表现为肺结节的Ⅰ期肺癌也具有较高的敏感性，有助于提高肺结节定性诊断的精准度。李金波等[10]回顾性分析58例肺结节患者（良性组22例与恶性组36例），采用配体靶向聚合酶链反应法检测两组患者的CTC，比较其与癌胚抗原、细胞角蛋白21片段水平差异，结果发现CTC对肺结节的诊断敏感度、特异度分别为84%、86%，同时还发现CTC在治疗时的水平与预后具有相关性。丁运等人[11]比较了CTC与癌胚抗原鉴别肺结节良恶性的差别，结果发现CTC比癌胚抗原具有更高的敏感度和特异度，且CTC的高低水平与临床肺癌淋巴结转移及术后TNM分期具有相关性。

此外，CTC携带了大量肺癌生物信息，在肺癌的发生、转移中扮演了重要角色，因此对于CTC的充分利用不仅可以提高早期诊断肺癌的可能性，而且可以通过对其携带生物信息进一步为肺癌提供精准的治疗方案。虽然目前CTC的检测及分析技术仍有一定局限性，但随着科技的发展，CTC将在肺结节等肺癌的早期诊断中扮演举足轻重的角色。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的定義

ctDNA是肿瘤细胞凋亡或坏死后释放出来的遗传物质，与肿瘤组织DNA具有高度的一致性。研究发现，肿瘤患者体内血浆游离DNA的平均含量约是健康人体的6倍，可作为早期诊断、治疗效果评价与治疗后临床随访的重要监测指标[12]。目前，ctDNA检测技术主要包括二代测序技术、数字PCR和等位基因特异性PCR。

2.2 ctDNA在肺结节诊疗中的应用

2016 年美国食品药品管理局先后批准了针对非小细胞肺癌患者ctDNA检测试剂盒[13]和基于NGS检测技术的ctDNA诊断试剂盒的使用[14]。表明了ctDNA检测对非小细胞肺癌患者的诊断和治疗具有重要的价值。CHEN等[15]前瞻性地收集了58例早期NSCLC患者（ⅠA期、ⅠB期和ⅡA期）的血液和肿瘤样本，并采用靶向测序方法检测匹配的肿瘤DNA （tDNA）和血浆ctDNA的体细胞驱动突变基因，发现EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53等肺癌常见突变基因在血浆ctDNA和tDNA突变频繁。该研究证实了检测人群中血浆ctDNA突变用于肺癌早期筛查、诊断的可行性，并有望在肺结节的良恶性鉴别上发挥用武之地。LIANG等[16]通过比较肺恶性肿瘤和肺良性病变，从组织中了解DNA甲基化特征，最终建立了区分恶性结节和良性结节的诊断模型。该模型有望成为一种非侵入性但敏感的可以区分良恶性肺结节的诊断方法。PENG等[17]通过开展一项多中心研究，对192例可手术的肺部占位性疾病患者切下的组织行组织gDNA与血浆ctDNA的深度基因测序，检测ctDNA在诊断肺结节方面的价值，结果发现采用血浆ctDNA法检测时，肺癌敏感性为69%，特异性为96%。而当ctDNA突变与血清生物标志物联合时，该模型的敏感性和特异性分别提高到80%和99%，其中64%的癌症患者处于Ⅰ期，肺结节平均直径2.2 cm（0.5～4.0 cm），敏感性为63%。这些研究均证实了检测血液中ctDNA有助于肺结节的定性诊断，提高恶性结节的检出率，早期发现肺癌使患者获得良好的预后。

综上，ctDNA不仅可以促进肺癌的精准医疗，用于疗效评价、耐药性检测和预后评估，还可以在肺结节的早期评估定性中发挥重要作用。

3 外泌体

3.1 外泌体的定义

外泌体是可在血浆、唾液、尿液等多种体液中检测到的直径为30～100 nm的细胞外囊泡，可以包含来自其原始细胞的由脂质双分子层保护的生物活性miRNA、mRNA或DNA，在细胞间通信中发挥作用[18～19]，此外，外泌体在各种温度和酸碱度中极其稳定，外泌体可能是诊断各类癌症的潜在生物指标[20]。研究证实在肿瘤的发生和转移过程中，肿瘤细胞分泌的外泌体发挥了重要作用，在促进肿瘤血管生成，参与肿瘤耐药性发生、免疫调节、信号传导等作用[21]。目前，常用的外泌体分离技术如过滤离心法、超速离心法、密度梯度离心法等。分离后进一步通过各种蛋白质和基因检测手段检测外泌体的生物信息。

3.2 外泌体在肺结节诊疗中的应用

外泌体中含多种蛋白质，如鼠类肉瘤病毒癌基因蛋白、表皮生长因子受体、紧密连接蛋白等，这些蛋白与肺癌发生、发展及转移密切相关[22]。外泌体中含有几十种有可能成为非小细胞肺癌的特异性生物蛋白及因子[23]，且在肺癌患者的外泌体中微小RNA也具有特异性[24]，因此外泌体是肺癌的重要标志物， 对肺癌的早期诊断极其重要[25]。SANDFELD等[26]证实外泌体膜结合蛋白等外泌体相关蛋白在肺癌患者表达增加且与肺癌患者总体生存时间呈相关性。外泌体还可以作为肺癌治疗药物的药物载体，提高其药物的靶向性而增加治疗效果[27]。JIN等[28]发现腺癌和鳞状细胞癌患者的外泌体中具有特异性miRNA。

综上所述，外泌体可能成为高敏感性、非侵入性的早期肺癌诊断生物标志物，有应用于肺结节定性诊断的价值，但目前已经发表的相关研究仍较少。

4 微小核糖核酸（miRNA）

4.1 miRNA的定义

液体活检中检测miRNA是通过在体液（通常是外周血）中检测miRNA协助肿瘤诊疗的一种检测方法，miRNA是具有调控功能的非编码RNA，大小长为20～25个核苷酸。研究发现，miRNA通过介导转录后沉默以调节细胞活性等方面在肿瘤发生、发展及转移中起关键信息传导作用[29]。许多研究团队都在寻找肿瘤患者和健康人群中miRNA的差异以便为肺癌早期诊断寻找标记，其中let-7家族、miRNA-21等在肺癌患者中表达具有特异性，可能成为对肺结节进行定性及肺癌筛查或早期诊断的工具[30～31]。miRNA的常用检测方法包括RT-PCR、微阵列法（microarray）、Northern blot。

4.2 miRNA在肺结节诊断中的应用

通过比较肺癌和正常对照组患者血浆中的多种miRNA，SOZZI等[32]和MONTANI等[33]发现在肺癌患者中miRNA具有较高的特异性，说明了miRNA测定在肺癌诊断中具有较高的应用价值。考虑到单个miRNA对肿瘤发病影响稍小，BIANCHI等建立一个包含了34个miRNA检测组成的模型[34]，应用该模型可以从无症状高危肺癌人群中識别出早期肺癌患者，准确性为80%;还可以区分在肺部CT中发现的高危人群中的肺小结节的性质，在肺结节和肺癌高危人群的筛查中具有巨大潜力。为了阐明肺癌与肺部良性疾病之间miRNA的表达是否存在差异，FAN等[35]对非小细胞肺癌、良性肺结节和肺部炎症疾病患者血清中的miRNAs进行了研究。结果发现有5个miRNA的比率在非小细胞肺癌组的表达高于良性肺结节组，敏感性为0.70，特异性为0.90。说明miRNAs的比值可作为恶性肺结节的潜在非侵入性生物标志物。

以上研究显示了miRNA在作为肺部结节诊疗方面的巨大潜质，但miRNA在定量检测时存在内参/外参基因的选择上存在不一致以及各种来源的miRNA在获取过程中质量和数量的差异较大等等问题。因此，目前miRNA在肿瘤的诊疗中仍处于临床前期研究，需要大量更规范研究促使miRNA的临床应用成为可能。

5 肿瘤血小板（TEPs）

5.1 肿瘤血小板的定义

肿瘤血小板概念指的是机体在与肿瘤细胞对抗过程中，肿瘤细胞和肿瘤微环境释放的生物分子可能使血小板中发生剪接事件从而形成了TEPs[36]。还有研究发现血小板可以摄取并保护肿瘤的外泌体，使之不被降解[37]。 由于TEPs中含有RNA等生物分子，通过应用测序或者定量分析的手段，就可以获得肿瘤患者体内这些相应生物分子的组成及其状态，从而为肿瘤的诊疗提供参考。因此，TEPs可能作为肺结节定性诊断的生物标志物[37]。

5.2 肿瘤血小板在肺结节诊疗中的应用

2017 年，有研究通过对非小细胞肺癌进行TEPs检测，应用粒子群优化（particle swarm optimization，PSO）算法可以有效地从血小板RNA序列库中选择RNA生物标记板，在早期和晚期非小细胞肺癌其准确性大于80%[38]。PSO算法是一种为选择一个稳健的生物标志物集合而用于识别最佳的生物标志物的算法[39]，能够从血小板RNA测序文库中有效地选择RNA生物标志物组。应用PSO算法可使基于TEPs检测早期和晚期NSCLC的准确度提高，有助有识别早期肺结节的性质。ZU等[40]通过研究血液和富血小板血浆中的整合血小板特征期望建立肺癌的诊断模型并区分肺结节的良恶性，结果发现肺癌患者在全血平均血小板体积、平均血小板体积、富血小板血浆、血小板计数和血小板回收率等多种血小板特征有显著差异。XING等[41]通过比较小于2 cm的孤立性肺恶性结节与良性结节的血小板源性ITGA2B mRNA水平，肯定了TEPs在鉴别肺结节良恶性方面的能力，测量TEP ITGA2B mRNA有助于临床医生在影像学发现的肺结节人群中筛选出恶性结节患者，从而实施个体化的治疗，提高早期肺癌患者的总体生存率。

6 小结

肺癌仍然是威胁人类健康的高发病率、高致死率的癌症，肺结节的发现为早期发现诊断肺癌提供了机会，液体活检在肺结节诊疗中发挥着巨大作用，可用于肺结节的定性诊断，进一步促进了肺癌精准医学的发展。目前，由于技术限制，虽然液体活检仍存在许多局限性，但是相比于影像学，早期可以在血液中检测到相应的生物标志物，为人类早期发现肿瘤提供可能性。

参考文献

[1] HIRSCH F R，SCAGLIOTTI G V，MULSHINE J L，et al.Lung cancer：current therapies and new targeted treatments[J].Lancet，2017，389（10066）：299-311.

[2] WOOD D E， KAZEROONI E A， BAUM S L， et al. Lung cancer screening， version 3.2018， NCCN clinical practice guidelines in oncology[J]. Journal of the National Comprehensive Cancer Network Jnccn， 2018， 16（4）：412-441.

[3] MACMAHON H， NAIDICH D P， GOO J M， et al. Guidelines for management of incidental pulmonary nodules detected on CT images：from the fleischner society 2017[J].Radiology，2017，284（1）：228-243.

[4] ITO M，MIYATA Y， OKADA M.Management pathways for solitary pulmonary nodules[J].J Thorac Dis，2018，10（suppl 7）：S860-S866.

[5] SLEIJFER S，GRATAMA J W， SIEUWERTS A M，et al.Circulating tumour cell detection on its way to routine diagnostic implementation？[J].Eur J Cancer，2007，43（18）：2645-2650.

[6] PATERLINI-BRECHOT P， BENALI N L. Circulating tumor cells （CTC） detection：Clinical impact and future directions[J].Cancer Lett，2007，253（2）：180-204.

[7] ILIE M，HOFMAN V，LONG-MIRA E，et al.“Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].PLoS One，2014，9（10）：e111597.

[8] RIED K，ENG P，SALI A.Screening for circulating tumour cells allows early detection of cancer and monitoring of treatment effectiveness：an observational study[J].Asian Pac J Cancer Prev，2017，18（8）：2275-2285.

[9] YU Y，CHEN Z，DONG J，et al.Folate receptor-positive circulating tumor cells as a novel diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer[J].Transl Oncol，2013，6（6）：697-702.

[10] 李金波，胡亞锋，屈志刚，等.循环肿瘤细胞检测在肺结节诊断及治疗个体化中的应用[J].临床和实验医学杂志，2020，19（16）：1791-1793.

[11] 丁运， 尤培林， 郭天兴，等. 循环肿瘤细胞在低剂量螺旋CT检出孤立性肺结节中的诊断价值[J]. 中华实验外科杂志， 2020， 37（7）：1331-1334.

[12] TAMKOVICH S，LAKTIONOV P.Cell-surface-bound circulating DNA in the blood：biology and clinical application[J].IUBMB Life，2019，71（9）：1201-1210.

[13] KEPPENS C，PALMA J F，DAS P M，et al.Detection of EGFR variants in plasma：a multilaboratory comparison of a real-time PCR EGFR mutation test in Europe[J].J Mol Diagn，2018，20（4）：483-494.

[14] BALASUBRAMANIAM S，BEAVER J A，HORTON S，et al.FDA approval summary：rucaparib for the treatment of patients with deleterious BRCA mutation–associated advanced ovarian cancer[J].Clin Cancer Res，2017，23（23）：7165-7170.

[15] CHEN K Z，LOU F，YANG F，et al.Circulating tumor DNA detection in early-stage non-small cell lung cancer patients by targeted sequencing[J].Sci Rep，2016，6：31985.

[16]  LIANG W H，ZHAO Y，HUANG W Z，et al.Non-invasive diagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNA methylation sequencing of circulating tumor DNA （ctDNA）[J].Theranostics，2019，9（7）：2056-2070.

[17] PENG M Y，XIE Y C，LI X H，et al.Resectable lung lesions malignancy assessment and cancer detection by ultra-deep sequencing of targeted gene mutations in plasma cell-free DNA[J].J Med Genet，2019，56（10）：647-653.

[18] RODRGUEZ M，SILVA J，LPEZ-ALFONSO A，et al.Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer[J].Genes Chromosomes Cancer，2014，53（9）：713-724.

[19] TAVERNA S，GIALLOMBARDO M，GIL-BAZO I，et al.Exosomes isolation and characterization in serum is feasible in non-small cell lung cancer patients：critical analysis of evidence and potential role in clinical practice[J].Oncotarget，2016，7（19）：28748-28760.

[20] KAHLERT C，KALLURI R.Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression and metastasis[J].J Mol Med （Berl），2013，91（4）：431-437.

[21] YU S，CAO H，SHEN B，et al.Tumor-derived exosomes in cancer progression and treatment failure[J].Oncotarget，2015，6（35）：37151-37168.

[22] LIU S，ZHAN Y，LUO J，et al.Roles of exosomes in the carcinogenesis and clinical therapy of non-small cell lung cancer[J].Biomed Pharmacother，2019，111：338-346.

[23] HE L，HANNON G J.MicroRNAs：small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet，2004，5（7）：522-531.

[24] ROLFO C，CASTIGLIA M，HONG D，et al.Liquid biopsies in lung cancer：the new Ambrosia of researchers[J].Biochim Biophys Acta，2014，1846（2）：539-546.

[25] FUJITA Y，KUWANO K，OCHIYA T，et al.The impact of extracellular vesicle-encapsulated circulating microRNAs in lung cancer research[J].Biomed Res Int，2014，2014：486413.

[26] SANDFELD-PAULSEN B，AGGERHOLM-PEDERSEN N，BK R，et al.Exosomal proteins as prognostic biomarkers in non-small cell lung cancer[J].Mol Oncol，2016，10（10）：1595-1602.

[27] KIM M S，HANEY M J，ZHAO Y，et al.Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR in cancer cells[J].Nanomedicine，2016，12（3）：655-664.

[28] JIN X C，CHEN Y F，CHEN H B，et al.Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early-stage non-small cell lung cancer using next-generation sequencing[J].Clin Cancer Res，2017，23（17）：5311-5319.

[29] HOU J，MENG F，CHAN L W，et al.Circulating plasma MicroRNAs as diagnostic markers for NSCLC[J].Front Genet，2016，7：193.

[30] ZHANG H，MAO F，SHEN T Y，et al.Plasma miR-145，miR-20a，miR-21 and miR-223 as novel biomarkers for screening early-stage non-small cell lung cancer[J].Oncol Lett，2017，13（2）：669-676.

[31] YANG J S，LI B J，LU H W，et al.Serum miR-152，miR-148a，miR-148b，and miR-21 as novel biomarkers in non-small cell lung cancer screening[J].Tumour Biol，2015，36（4）：3035-3042.

[32] SOZZI G，BOERI M，ROSSI M，et al.Clinical utility of a plasma-based miRNA signature classifier within computed tomography lung cancer screening：a correlative MILD trial study[J].J Clin Oncol，2014，32（8）：768-773.

[33] MONTANI F，MARZI M J，DEZI F，et al.miR-Test：a blood test for lung cancer early detection[J].J Natl Cancer Inst，2015，107（6）：djv063.

[34] BIANCHI F，NICASSIO F，MARZI M，et al.A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer[J].EMBO Mol Med，2011，3（8）：495-503.

[35] FAN L H，SHA J，TENG J L，et al.Evaluation of serum paired MicroRNA ratios for differential diagnosis of non-small cell lung cancer and benign pulmonary diseases[J].Mol Diagn Ther，2018，22（4）：493-502.

[36] BEST M G，SOL N，KOOI I，et al.RNA-seq of tumor-educated platelets enables blood-based Pan-cancer，multiclass，and molecular pathway cancer diagnostics[J].Cancer Cell，2015，28（5）：666-676.

[37] NILSSON R J，BALAJ L，HULLEMAN E，et al.Blood platelets contain tumor-derived RNA biomarkers[J].Blood，2011，118（13）：3680-3683.

[38] BEST M G，SOL N，IN 'T VELD SGJG，et al.Swarm intelligence-enhanced detection of non-small-cell lung cancer using tumor-educated platelets[J].Cancer Cell，2017，32（2）：238-252.e9.

[39] BONYADI M R，MICHALEWICZ Z.Particle swarm optimization for single objective continuous space problems：a review[J].Evol Comput，2017，25（1）：1-54.

[40] ZU R，YU S，YANG G，et al.Integration of platelet features in blood and platelet rich plasma for detection of lung cancer[J].Clin Chim Acta，2020，509：43-51.

[41] XING S，ZENG T，XUE N，et al.Development and validation of tumor-educated blood platelets integrin alpha 2b （ITGA2B） RNA for diagnosis and prognosis of non-small-cell lung cancer through RNA-seq[J].Int J Biol Sci，2019，15（9）：1977-1992.

（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-01-29）

（編辑：梁明佩）

基金项目：国家自然科学基金（82060078）;广西自然科学基金（2016GXNSFAA380196）

作者简介：李柏钧，男，副主任医师，医学博士，研究方向：胸外科。E-mail：2364313910@qq.com

[本文引用格式]李柏钧，温昭科.液体活检在肺结节诊疗中的应用现状及前景[J].右江医学，2021，49（4）：299-303.