基质金属蛋白酶-1 mRNA、A-2 巨球蛋白 mRNA 在创伤性关节炎病人软骨中的表达及与病情严重程度的相关性

冯利君，张允帅，王宸

作者单位：开封市中心医院骨科，河南 开封 475000

创伤性关节炎（Post-traumatic osteoarthritis，PTOA）主要以关节软骨退化、变性及继发性关节软骨增生与硬化为病理特点，可引起关节疼痛与功能障碍，严重降低病人生活质量。基质金属蛋白酶-1（Matrix metalloproteinase-1，MMP-1）作用底物主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和蛋白多糖，在大鼠骨性关节炎、类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）中呈高表达。A-2 巨球蛋白（A-2 macroglobulin，A2M）是一种广谱的蛋白酶抑制剂，在股骨头坏死者关节囊滑膜组织中呈低表达。 现阶段关于 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 在PTOA病人软骨中的表达及与病情严重程度相关性的报道较少，是否有助于鉴别 PTOA、RA 仍不明确。本研究对此进行探讨，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取开封市中心医院 2018年 1月至 2019年 6月收治的 PTOA 病人 76例作为PTOA 组 ，另选取同期该院 RA 病人72例作为 RA组。两组性别、年龄等一般资料均衡可比（

P

＞0.05），见表1。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

表1 两组创伤性关节炎病人临床资料对比

1.2 纳排标准

纳入标准 ：PTOA、RA 分别符合PTOA、RA 诊断标准；以往无 PTOA、RA 手术治疗史；入组前 1 个月无相关药物应用史；无血液系统疾病。排除标准：合并膝关节结核者；合并骨折者；妊娠期、哺乳期病人。

1.3 方法

1.3.1 软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表达的检测 （1）主要试剂、仪器：Trizol（武汉科昊佳生物科技有限公司）；RNase-free ddHO（上海索宝生物科技）；Prime ScriptRT Enzyme Mix［宝生物（大连）工程有限公司］；5×PrimeScript Buffer［宝生物工程（大连）有限公司］；Nuclease-Free Water（北京冬歌博业生物科技有限公司）；荧光定量 PCR 仪（美国 ABI-7300）。（2）检测方法：治疗前，均在病人知情同意条件下，采集适量胫骨平台软骨组织，液氮保护下研磨成碎末，加入含有 1 mL Trizol 的 EP 管中，冰上静置 15 min，加入 0.2 mL 三氯甲烷，充分混匀，室温放置 5 min，12 000 r∕min 离心 15 min，转移上层水相500 μL 至 新 的 EP 管中，加入等体积的异丙 醇，混匀，室温静置 20 min，12 000 r∕min 离心 10 min，上清弃之，可见细小白色胶状沉淀。加入 1 mL 预冷的用RNase-free ddHO 与 100% 乙醇配置的 75% 冰乙醇，8 000 r∕min 离心 5 min，管内液体弃之，室温放置 0.5 h，加入 RNase-free ddHO 20 μL 混匀，分光光度计检测总 RNA 纯度与质量。按以下逆转录反应体系进行逆转录反应，条件 37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 s，4 ℃ 60 min，得到互补 DNA（cDNA），采用实时荧光定量PCR 检测各基因表达，引物序列、PCR 反应体系如下，反应条件 95 ℃ 15 min 预变性，95 ℃ 5 s 变性，55 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 30 s 延伸，溶 解曲 线 95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，循环 1 次，4 ℃保存，用相对内参的表达量表示各目的基因表达量。由该院检验室统一完成，以上检验过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 PTOA 病情评估 采用 X 线 ellgren&Lawrence分级标准，Ⅰ级：轻微骨赘；Ⅱ级：明显骨赘，但未累及关节间隙；Ⅲ级：关节间隙中度变窄；Ⅳ级：关节间隙明显变窄，软骨下骨硬化。

1.4 观察指标

（1）比较两组软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表达量。（2）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鉴别诊断 PTOA、RA 的截断值、灵敏度、特异度。（3）不同病情病人软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 膝 关 节 评 分 法（Knee society score，KSS）、美国特种 外科医院（Hospital for special surgery，HSS）评分：KSS、HSS 评分满分 100 分，分值与均膝关节功能呈正比。（4）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 与 PTOA 病情程度的相关性。（5）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表达量与 KSS、HSS 评分相关性。

2 结果

2.1 两组软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表达量比较

PTOA 组软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA低于RA组（

P

＜0.05），见表2。

表2 两组关节炎病人软骨中MMP-1 mRNA、A2M mRNA表达量比较∕

2.2 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 对 PTOA、RA 鉴别诊断价值

ROC 分析显示，MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鉴别诊断 PTOA、RA 的 AUC 为 0.909，大于单一的 MMP-1 mRNA、A2M mRNA，灵敏度为 89.47%，特异度为 80.56%。见表3。

2.3 不同病情病人软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 评分

MMP-1 mRNA、随病情分级增加呈逐渐升高趋势 ，A2M mRNA 表 达 量 、KSS、HSS 评分呈下降趋势（

P

＜0.05），见表4。

表4 不同创伤性关节炎病情病人软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 评分∕

2.4 MMP-1 mRNA、A2M mRNA与PTOA病情程度的关系

logistic 回归分析显示，MMP-1 mRNA、A2M mRNA 与 PTOA 病情程度显著相关（

P

＜0.05），见表5。

2.5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表达量与 KSS、HSS 评分相关性

Pearson 相关性分析 ，MMP-1mRNA 与 KSS、HSS 评分呈负相关（

r

= - 0.575、-0.541，均

P

＜0.05），A2M mRNA 表达量与 KSS、HSS评分呈正相关（

r

=0.592、0.610，均

P

＜0.05）。

表5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 与创伤性关节炎（PTOA）病情程度的关系

3 讨论

PTOA 好发于年轻人群，严重影响病人生活质量，且由于年轻人不适合行关节融合或置换术，给家庭、社会带来较大负担，故加强对 PTOA 的研究意义重大。

3.1 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鉴别诊断PTOA、RA 的价值

RA 是与 PTOA 相似的一种关节疾病，两者临床特征相似，鉴别诊断存在一定难度。MMP-1 是基质金属蛋白酶家族成员之一，A2M主要由肝脏等产生，具有广谱蛋白酶抑制作用。但目前关于 MMP-1、A2M 在 RA、PTOA 中表达水平比较的报道较少。本研究结果显示，PTOA 病人软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 低于 RA 病人，可能与 RA 病人基质金属蛋白酶∕金属蛋白酶组织抑制因子失衡严重有关。且 MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鉴别 诊 断 PTOA、RA 的 AUC 为 0.909，大于单一的MMP-1 mRNA、A2M mRNA，灵敏度为 89.47%，特异度为 80.56%，呈现出较高价值，可为临床鉴别诊断PTOA、RA 提供量化参考。

3.2 MMP-1 mRNA 在 PTOA 软骨中表达及与病情的相关性

MMP-1 可降解细胞外基质中的胶原纤维和明胶，改变细胞的微环境，破坏细胞外基质，不利于损伤细胞的修复。本研究发现，MMP-1 mRNA 与 PTOA 病情程度、KSS、HSS 评分显著相关，提示检测 MMP-1 mRNA 表达可评估 PTOA 病人病情严重程度与关节功能。根据 Xu 等研究，MMP-1基因多态性与骨关节炎的发病密切相关。动物学研究表明，MMP-1 在 RA 大鼠模型中呈高表达，与病情的改善有关，支持本研究结论。PTOA 病人关节存在炎症反应，诱导白介素-1、肿瘤坏死因子-α 等炎性因子，并介导细胞外基质过度降解，对软骨细胞保护作用减弱，导致软骨细胞受损、坏死，软骨层变薄等退变现象，因此可引起疼痛、关节活动受限等症状体征，且 MMP-1 水平越高，基质金属蛋白酶∕金属蛋白酶组织抑制因子失衡越明显，软骨破坏越严重，故病人病情越严重。表明抑制 MMP-1 表达可能有助于 PTOA 病人病情及关节功能的改善。

表3 MMP-1 mRNA、A2M mRNA对PTOA、RA鉴别诊断的 ROC分析结果

3.3 A2M mRNA 在 PTOA 软骨中表达及与病情的相关性

A2M 是血浆中分子量最大的蛋白质，能结合多种离子、分子、蛋白水解酶。本研究结果显示，随病情分级增加呈逐渐升高趋势，A2M mRNA表达量呈下降趋势，A2M mRNA 与 PTOA 病情程度、KSS、HSS 评分显著相关 ，提示检测 A2M 可 评 估PTOA 病人病情与关节功能。Li 等报道显示，早期补充 A2M 能通过抑制胶原蛋白Ⅱ诱导的关节炎模型中的炎症来减轻软骨和骨骺损伤，从侧面论证了本研究 A2M mRNA 表达量与 KSS、HSS 评分呈正相关的结论。Liu 等研究指出，下调软骨细胞中miR-146b 的表达，可抑制白介素-1β 诱导的胱天蛋白酶活化和蛋白水解酶的表达，起到软骨保护与抑制骨关节炎进展作用，采用萤光素酶报告基因测定证实，软骨细胞中 A2M mRNA 是 miR-146b 的 靶 基因，提示调控 A2M mRNA 表达，可能为 PTOA 的保守治疗提供一个潜在思路。分析其原因可能是，A2M能通过抑制 MMP-1 等基质金属蛋白酶，保护细胞外基质，促进基质金属蛋白酶∕金属蛋白酶组织抑制因子动态平衡的恢复与软骨细胞微环境的改善，防止软骨细胞的破坏，故是 PTOA 病人病情的保护因素，与 KSS、HSS 评分呈正相关。本研究不足之处在于，纳入病例数较少，可能会影响数据，且软骨组织标本的采集具有一定创伤 ，仍需后续的进一步完善。

软骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 可诊断鉴别PTOA、RA，并与 PTOA 病人病情、关节功能显著相关 ，调 控 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表 达 可 能 为PTOA 的治疗提供了一个潜在思路。