巨噬细胞移动抑制因子和细胞间黏附分子-1 在慢性牙周炎合并动脉粥样硬化大鼠模型中的表达分析

庞雪晶

作者单位：昆明市儿童医院口腔科，云南 昆明 650000

慢性牙周炎（CP）是发生于牙周支持组织的一种慢性炎性疾病，伴有进行性的牙周组织附着丧失和牙槽骨吸收破坏。动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病发生率和死亡率的主要原因。流行病学调查显示牙周炎可增加人患心血管疾病的风险，口腔细菌感染与心血管疾病之间存在密切联系。研究表明牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）感染导致牙周软组溃疡出血，进而入血、黏附和侵入血管内壁引起局部炎症反应，是促进 AS 发展的重要原因。

巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种多功能蛋白 ，作为细胞因子起作用 ，是炎症的主要调节因子。MIF 作为动脉粥样硬化形成的主要调节因子之一，通过促进单核细胞的募集，激活炎症信号通路，将巨噬细胞转分化为泡沫细胞以及增强胶原酶表达和基质降解，可导致 AS 斑块不稳定，这直接关系到疾病的进展。将载脂蛋白基因（ApoE-∕-）或低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠的 MIF 表达阻断，可使已形成的 AS 斑块退缩变小。由此可见 MIF 在AS 病变中具有重要作用 。 细胞间黏附分子 -1（ICAM-1）的表达和活性升高是内皮功能障碍表型的特征，在 AS 形成期间，内皮细胞使黏附分子表达升高，启动细胞骨架重组，这是单核细胞募集到血管壁中不可或缺的。近年来，ICAM-1 在牙周炎中的作用逐渐得到关注，ICAM-1 是牙龈表面的黏附蛋白，主要通过细胞间信息传递、验证和免疫反应参与牙周炎的发生和发展过程。慢性牙周炎组织中的 ICAM-1 升高进而影响血清中 ICAM-1 的水平，血液中 ICAM-1 的升高可导致循环系统中的白细胞与血管内皮细胞的黏附，引发心血管疾病的发生。

本研究于 2019年 1—12月通过建立牙周炎动脉粥样硬化的复合动物模型，在体内验证 P.gingivalis 造成的牙周感染是否可使大鼠血清中及动脉组织中 MIF、ICAM-1 表达升高。本研究将为阐明慢性牙周炎感染促进 AS 样疾病的发生发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细菌培养

牙龈卟啉单胞菌菌株常规复苏后接种于 BHI 血琼脂培养基，37 ℃厌氧条件（80% 氮气、10% 二氧化碳、10% 氢气）培养 5～7 d，取菌落传代培养 3～4 d，液体增菌 1～2 d，紫外分光光度计 600 nm 下调整菌液浓度至大约 1.0×10CFU∕mL，用于大鼠口腔接种。

1.2 实验动物及分组

24 只健康的雄性 SD 大鼠，8周龄，体质量范围为（220±10）g，动物饲养于 SPF 级动物房。用随机数字法分配为四组，分别为 NC 组、CP 组、AS 组及 CP+AS 组，每组各 6 只。实验前所有大鼠饮水中给予复方磺胺甲噁唑片即 1 g∕L 磺胺甲噁唑和 200 mg∕L 的甲氧苄胺嘧啶 3 d 以抑制不利于牙龈卟啉单胞菌定植的内源性细菌。实验动物使用许可证号为 SYXK（粤）2019-0074，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.3 建模方法

NC 组：腹腔注射生理盐水及口腔内涂生理盐水作为对照，标准饲料饲养 12周。CP组：将牙龈卟啉单胞菌（1.0×10CFU∕mL）接种于上颌第二磨牙龈沟内。以后在异氟烷镇静下每周接种 2 次，标准饲料喂饲，每周检查结扎丝 1 次，有脱落者及时重新结扎。AS 组：先标准饲料喂饲，1周内逐渐增加高脂饲料比例直至完全替代标准饲料（高脂饲料喂饲 20～25 g∕d）。在高脂饮食的基础上于行大鼠左侧颈动脉内膜球囊损伤术（参照 Tulis的手术方法）。同时腹腔注射维 生素 D3 针剂 60 万 IU∕Kg，从第2周每周腹腔注射 1 次维生素 D3 10 万 IU∕Kg，共注射 3 次。高脂饲料继续喂养 12周。CP+AS组：牙周炎建模处理同 CP 组，动脉粥样硬化建模处理同 AS 组。

1.4 取材

大鼠处死前 12 h 禁食不禁水，将大鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上进行取材。

1.5 观察记录与检测

每天观察大鼠精神状态，每周更换新鲜饮水。每 2周进行 1 次体质量的测量。由同一人使用 Hu-Friedy 牙周探针测量上颌左、右第二恒磨牙龈沟出血指数（SBI）（1971，Muhleman 和Son 记分标准记 0～5 分），取平均值。在放大的体视显微镜下（×40）对染色后的上颌第二磨牙的颊舌侧进行标准化的图像采集。用橡皮泥做两个约 3 cm的长条，将颌平面与长条垂直，牙齿长轴与相机垂直。长条上有固定参考点来保证照片的标准化。Image-Pro Plus6.0 软件分析颊腭侧由釉牙骨质界（CEJ）、近远中轴线角、牙槽嵴顶所围成的多边形面积，比较面积的大小从而推测骨吸收的多少。颊舌侧面积之和记为该鼠的骨丧失量。将 4% 的多聚甲醛固定的动脉组织进行脱水石蜡包埋切片，常规苏木精-伊红（HE）染色后光学显微镜下观察，评估颈动脉病变情况。

1.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中 MIF及 ICAM-1 的表达

从-80 ℃超低温冰箱中取出血清样本，在室温解冻半小时以上，检测前根据预试验结果稀释 ，用 ELISA 试剂盒测定标本中 MIF 及ICAM-1 含量。

1.7 免疫组化检测动脉组织中 MIF 及 ICAM-1 的表达

石蜡切片脱蜡，浸泡于 3% 过氧化氢中，洗涤后，MIF 抗体或者 ICAM-1 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗，37 ℃ 30 min，PBS 冲洗，DAB 显色，复染，封片；与抗体相结合的区域出现棕黄色的改变，细胞质中的棕黄色程度越高，代表阳性反应越强 。 通过图像分析软件 Image-pro Plus 6.0 对动脉组织中 MIF 和 ICAM-1 阳性区域进行半定量分析：在高倍镜下（×200），每张切片随机选取 3 个不同视野，对血管组织中 MIF 和 ICAM-1 染色阳性部位的透光强度进行分析，结果用平均吸光度表示，将 3 个视野的平均值作为此片 MIF 和 ICAM-1含量的最终数据。

2 结果

2.1 牙槽骨吸收水平分析

体视显微镜图示（图1），IPP 图像分析软件显示：NC 组牙槽骨吸收面积为（5.11±0.99）mm，CP 组 为（9.46±3.07）mm，AS 组为（5.50±0.74）mm，CP+AS 组 为（9.58±3.53）mm。CP 组及 CP+AS 组牙槽骨吸收面积高于其他两组（

P

＜0.05）。结合 SBI 数据结果，可认为本实验 CP 组及CP+AS 组成功建立起牙周炎动物模型。

2.2 血脂的检测分析

血脂检测结果显示 AS 组、CP+AS 组三酰甘油、总肝固醇、LDL 均较 NC 组、CP组升高（

P

＜0.05），其中 AS 组升高最为明显，其次为CP+AS 组；AS、CP+AS 组 HDL 较 NC、CP 组降低（

P

＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清血脂水平比较∕（mmol∕L

2.3 颈动脉组织病理组织学检查结果

病理组织学检查显示：NC 组可见内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层血管内皮细胞覆盖，细胞完整，中膜主要可见排列整齐平滑肌细胞。CP 组与 NC 组病理表现相似，但中膜平滑肌细胞增生，动脉壁略增厚，有极少量炎性细胞浸润。AS 组、CP+AS 组管壁内皮细胞脱落，内膜增厚，突出的斑块内含有坏死物质，炎性细胞浸润以及少量的泡沫细胞，平滑肌细胞减少，排列紊乱，嗜碱性增强，中膜明显萎缩，可见小血管管腔。结合血脂数据结果可认为本实验 AS 组及 CP+AS 成功建立了大鼠动脉粥样硬化动物模型，见图2。

2.4 血清 MIF 及 ICAM-1 表达水平分析

2.4.1 血清 MIF 表达水平分析 血清 MIF 表达水平四组间比较：NC 组（42.93±2.63）μg∕L、CP 组（45.57±2.59）μg∕L、AS 组（50.88±4.20）μg∕L 及 CP+AS 组（59.40±3.92）μg∕L（

F

=36.723，

P

=0.011）。 AS 组 及CP+AS 组血清 MIF 水平高于 CP 组及NC组（

P

＜0.05），其中 CP+AS 组最高（

P

＜0.05）；CP 组 与 NC 组差异无统计学意义（

P

＞0.05）。2.4.2 血清 ICAM-1 表达水平分析血清 ICAM-1表达水平四组间比较：NC 组（1.33±0.25）μg∕L、CP 组（3.99±0.44）μg∕L、AS 组（4.19±0.89）μg∕L 及 CP+AS 组（6.77±1.47）μg∕L（

F

=33.821，

P

=0.002）。CP+AS 组高于其他三组（

P

＜0.05），AS 组与 CP 组高于 NC 组（

P

＜0.05），AS 组与 CP 组差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

2.5 动脉组织中 MIF 与 ICAM-1 表达水平分析

2.5.1 动脉组织中 MIF 表达水平分析 免疫组织化学染色显示，MIF 在动脉组织全层中均呈阳性表达，且 分 布面积 较广（图3A～3D）。四组 间比较 ：NC 组MIF 吸 光 度 为（0.096±0.010），CP 组 为（0.010±0.011），AS 组为（0.127±0.011），CP+AS 组为（0.152±0.022）（

F

=48.271，

P

＜0.001）。CP+AS 组 MIF 水平高于其他三组（

P

＜0.05），AS 组 MIF 水平高于 CP 组及NC 组（

P

＜0.05），CP 组与 NC 组之间差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

图1 体视显微镜观察各组大鼠牙槽骨破坏情况（×40）：A为NC组第二磨牙未见明显骨破坏；B为CP组第二磨牙牙槽骨吸收至牙根1/3～1/2；C为AS组第二磨牙未见明显骨破坏；D为CP+AS组第二磨牙牙槽骨吸收至牙根根尖1/3，根分叉区骨破坏 图2 各组大鼠动脉组织的病理图（HE染色×100）：A为NC组血管壁内膜、中膜及外膜界限明显，未见明显异常；B为CP组血管壁内膜、中膜及外膜界限明显，箭头示血管壁略增厚；C为AS组内膜明显增厚，炎细胞浸润，弹力纤维排列紊乱、断裂，黑色箭头示斑块内坏死物，灰色箭头示该区域嗜碱性增强；D为CP+AS组内膜明显增厚，炎细胞浸润，弹力纤维排列紊乱、断裂，黑色箭头示中性粒细胞浸润，灰色箭头示小血管管腔形成 图3 各组大鼠颈动脉组织中巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达（免疫组织化学染色×200）：A～D分别为NC组、CP组、AS组及CP+AS组MIF的表达水平；E～H分别为NC组、CP组、AS组及CP+AS组ICAM-1的表达水平

2.5.2 动脉组织中 ICAM-1 表达水平分析 免疫组织化学染色显示，ICAM-1 在动脉组织全层中均呈弱阳性表达（图3E～3H），四组实验大鼠组间比较：动脉组织中 NC 组 ICAM-1 吸光度为（0.133±0.012），CP组为（0.156±0.006），AS 组 为（0.182±0.025），CP+AS组 为（0.197±0.033）（

F

=42.283，

P

＜0.001）。 AS 组 、CP+AS 组 ICAM-1 水平高于 NC 组及 CP 组（

P

＜0.05），CP 组与 NC 组之间差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

3 讨论

颈动脉内膜中层厚度被认为是早期动脉粥样硬化的标志物 ，也是心血管结局的良好预测指标。因基因敲除小鼠较昂贵，饲养条件较严格，且口腔操作空间较大鼠更困难，所以在本实验中还是选取大鼠来建立动物模型。本实验另一个技术难点即球囊损伤术建立 AS 模型，对血管内皮进行机械损伤，加速病变的形成。病理结果显示虽未出现钙化斑块的形成，但近似于人类 AS 病变的中期即纤维斑块期。

三酰甘油 ，总肝固醇 ，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是高脂血症诊断和心血管疾病风险分类的主要测量指标。其中三酰甘油，总肝固醇，LDL-C 升高与 AS 发病呈正相关，HDL-C 有抗 AS 的作用。LDL 水平的升高受到最多关注，在几乎所有降脂试验中，LDL-C 水平已被用作治疗或干预的主要目标。在本实验中血脂检测结果可见 CP 组、CP+AS 组血清三酰甘油、总肝固醇 、LDL 水 平 较 NC 组、CP 组明显升高（

P

＜0.05），AS 组、CP+AS 组血清 HDL 水平较 NC 组、CP组明显低（

P

＜0.05）。大鼠的高脂血症形成。高血脂是建立 AS 模型的重要条件之一。研究表明 MIF 在心血管疾病的发生和发展中发挥着重要作用。有研究显示急性心梗病人的血浆中 MIF 水平要高于健康对照组。MIF 在人类动脉粥样硬化斑块形成中的各个阶段由动脉粥样硬化相关细胞（如平滑肌细胞、内皮细胞、单核细胞和T 细胞）大量表达。动物实验研究显示在正常情况下血管内皮细胞（VEC）中的 MIF 的 mRNA 表达呈弱阳性，不能观察到 MIF 蛋白表达，而在 AS 斑块处MIF 表达显著增高。研究表明，导致 AS 发生的因素（如氧化 LDL 和凝血酶）以时间和浓度依赖的方式上调 MIF 表达。本实验的研究显示 AS 组以及 CP+AS 组中血清及动脉组织中 MIF 表达水平较NC 组以及 CP 组较高（

P

＜0.05），与上述实验结果相一致。MIF 在牙周炎领域的研究目前较少，有研究表明在人类的龈沟液中可以检测出 MIF 的表达，在有深牙周袋的牙周组织中 MIF 表达水平升高，而在 Lira-Junior 等的研究发现 MIF 在正常组和牙龈炎组以及侵袭性牙周炎组的血清和唾液中的表达没有明显差别。在本实验中 NC 组以及 CP 组 MIF在血清及动脉组织中表达水平差异无统计学意义，因此 MIF 在 CP 中的确切作用需要更多研究来证实。在 CP 组、AS 组、CP+AS 组 MIF 的血清及动脉组织中表达水平依次升高，提示我们慢性牙周炎局部感染可能可以使血清 MIF 水平升高，从而促进动脉粥样硬化病变的发生发展过程。

ICAM-1 是一种重要的表面黏附分子，在动脉粥样硬化形成的各个阶段都有很重要的作用，已成为动脉粥样硬化形成的重要组成部分 。 可溶性的ICAM-1 存在于健康者及牙周炎病人的龈沟液中，在 ICAM-1 对结合上皮细胞的特异性辅助下，多形核白细胞可以进入牙龈和牙周袋，起到杀菌的作用，具有强效的免疫调节和抗炎特性，ICAM-1 水平与牙周炎症程度呈正相关。本实验结果显示：在血清 中 CP 组、AS 组及 CP+AS 组 ICAM-1 的表 达 水平均高于 NC 组，其中 CP+AS 组表达水平最高，可以推测慢性牙周炎的存在可能可以使血清中 ICAM-1 表达量升高，从而影响动脉粥样硬化的形成；动脉组织中 AS 组及 CP+AS 组 ICAM-1 的表达水平高于 NC组及 CP 组，CP+AS 组 ICAM-1 的表达水平略高于 AS组，但无统计学意义。可以推测慢性牙周炎的存在可能并没有使动脉组织中 ICAM-1 表达升高。

MIF 可以干扰黏附分子和细胞因子的表达，将MIF 的 RNA 沉默可降低 E-选择蛋白、ICAM-1、血管细胞黏附分子 1、白细胞介素-8 和趋化因子 2 的表达。既往已有细胞实验结果表明牙龈卟啉单胞菌感染血管内皮细胞时可以诱导 MIF 及 ICAM-1 的分泌增多。 利用MIF 拮抗剂 ISO-1 中 和 MIF 后 ，ICAM-1 的表达受到明显抑制；加入外源性 MIF 恢复其功能后 ICAM-1 表达量升高，说明牙龈卟啉单胞菌感染血管内皮细胞上调 ICAM-1 的表达有一定的MIF 依赖性。根据本实验结果可得出在 CP 促进 AS的进程中 MIF 和 ICAM-1 可能起到一定的调节作用，但两者在动脉粥样硬化形成过程中的相互作用在本实验中尚未证明，还需要其他实验来证实。比如利用 MIF 基因敲除的大鼠或其他体型较大的动物建立牙周炎和动脉粥样硬化的复合模型检测 ICAM-1的表达情况，从而探究两者之间的关系。本课题组可考虑后续实验对其进行验证。

综上所述，本实验通过建立牙周炎合并动脉粥样硬化的动物模型，检测了 MIF 及 ICAM-1 在蛋白水平的表达，为牙周炎和动脉粥样硬化之间关系提供了一定的理论基础。提示我们在临床工作中遇到伴有慢性牙周炎的心血管疾病病人时，应进行早期的诊断和积极的牙周治疗。完善的牙周治疗可以转化为炎性介质领域和脂质特征的标志物的改善，从而使心血管疾病风险降低。

（本文图1～3 见封三）