组织蛋白酶 L 对糖尿病大鼠肾脏炎症及氧化应激指标的影响

邱敏，陈波

作者单位：云南省第三人民医院肾病科，云南 昆明 650000

全球糖尿病患病人数在不断上升。糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症，也是导致糖尿病病人致残和死亡的重要原因。炎症反应和氧化应激在糖尿病肾病的发生发展过程中发挥关键作用。因此，寻找抑制炎症反应和氧化应激的有效调控靶点对糖尿病肾病的防治具有十分重要的科学意义。

组织蛋白酶 L（Cathepsin L，Cat L）具有木瓜蛋白酶家族的氨基酸序列，以酶原的形式贮存于溶酶体中，是一种有效的内肽酶，与溶酶体蛋白的降解有关。该酶参与多种生物学和疾病发生发展过程，包括骨骼更新，肌肉变性，动脉硬化和癌症转移。Cat L 的表达异常与多种肾脏疾病的触发有关，如膜性肾小球肾炎，微小变化疾病，局灶性节段性肾小球硬化和糖尿病肾病。有研究表明脂多糖或嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞 Cat L 高表达与蛋白尿的形成有关。相较于野生型小鼠，Cat L 基因敲除的小鼠未出现蛋白尿。最近有研究报道 Cat L 与炎症反应和氧化应激的触发有关。本研究于 2018年 6月至 2019年 5月拟通过观察 Cat L 对糖尿病大鼠肾脏炎症和氧化应激指标的影响，探讨 Cat L 在糖尿病肾病发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只健康雄性SPF级别 Sprague-Dawley（SD）大鼠（体质量范围为 240～270 g）购买自上海斯莱克实验动物科技服务部。采用随机数字表法分为对照组和糖尿病组，分别为 10 只和 20 只。拟糖尿病模型建立成功后，从糖尿病组取 10 只大鼠每天腹腔注射 10 mg∕kg Cat L 抑制剂 Z-FY-CHO，作为抑制剂组。

1.2 主要试剂及仪器

链脲佐菌素（STZ）购买自美国 Sigma 公司；CatL抑制剂（Z-FY-CHO）购自美国的Santa Cruza 公司；柠檬酸和柠檬酸三钠购自国药集团化学试剂有限公司；Cat L 活性检测试剂盒购自上海铭博生物科技有限公司；丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）和谷胱甘肽试剂盒均购买自南京建成生物工程研究所；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和白细胞介素-1（IL-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购买自上海广锐生物科技有限公司；DEPC 水购自碧云天生物科技有限公司；Trizol 裂解液购自美国 Invitrogen 公司 ；RNA 逆转录试剂盒及 SYBR® Green-ERTM SuperMix 购自大连宝生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；全自动生化分析仪购买自美国的 Beckman Coulter 公司；微量核酸蛋白测定仪购自美国的 Thermo Scientific 公司 ；StepOne Plus荧光定量PCR仪购自德国的Applied Biosystems 公司。

1.3 Ⅰ型糖尿病模型的建立

在模型建立前，先尾静脉采血测定大鼠的血糖值。将 STZ 溶于 0.1 mol∕L的柠檬酸缓冲液中，以 65 mg∕kg 剂量腹腔注射到大鼠体内，3 d 后检测血糖浓度。血糖值≥16.7 mmol∕L表明糖尿病模型建立成功。实验期间对照组与糖尿病组分别取 5 只大鼠每两周测定血糖与体质量。

1.4 血、尿标本的收集

建模后4周、8周 ，使用代谢笼收集三组大鼠 24 h 尿并记录尿量，以 4 ℃、1 500 r∕min 离心 5 min 纯化尿液后置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续的尿蛋白测定实验。下腔静脉采血后以 4 ℃、3 000

g

离心 10 min 取血清，全自动血液生化分析仪检测血尿素氮和血肌酐。

1.5 实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测各组大鼠肾脏组织中 Cat L mRNA 水平

4周、8周时三组各处死 5 只大鼠并取肾脏组织，加 1 mL Trizol研磨裂解，提出总 RNA，75% 乙醇 DEPC 水溶液充分洗涤 ，待液体挥干 ，根据RNA沉淀量加入适量的DEPC 水溶解。微量核酸蛋白测定仪测量 RNA 的核酸浓度和纯度，计算 RNA 的加样体积。按照逆转录试剂盒的说明书，去除样品中的基因组 DNA，再将RNA 反转录为模板互补 DNA（cDNA）。Cat L 引物序列为 ：正向 5’-TCTGTTGCTATGGACGCAAG-3’，反向 5’-CCGGTCTTTGGCTATTTTGA-3’。然后根据试剂盒说明书，确定扩增体系、进行扩增反应。

1.6 Cat L 活性检测

根据试剂盒说明书，用比色法测定 Cat L 活性。

1.7 肾脏组织中的丙二醛、SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽含量测定

称取适量的大鼠肾脏组织，于冰水浴下研磨制备肾组织匀浆，低温离心后留取上清。按照试剂盒说明书测定丙二醛、SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平。

1.8 ELISA 检测肾脏组织中的 IL-1、IL-6 和 TNF-α水平

将抗原稀释后加到各孔中，37 ℃条件下孵育4 h 后弃去；用 5% 小牛血清于 37 ℃下孵育 40 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗；接着加入待测样品，37 ℃孵育 30～45 min，PBS 洗涤；然后加酶标抗体，37 ℃孵育 40 min，PBS 洗涤；再加入底物液，37 ℃避光孵育 5 min；加终止液显色，测定 IL-1、IL-6 和 TNFα 水平。

2 结果

2.1 糖尿病大鼠的血糖和体质量情况

STZ 注射后，每两周测定大鼠血糖 和体质量。与对照组相比，糖尿病大鼠血糖持续增高，体质量逐渐减轻（

P

＜0.05），见表1，证明糖尿病模型建立成功。

2.2 糖尿病大鼠肾脏组织中 Cat L 表达和活性增加

建模后 4周、8周对照组与糖尿病组各收集并检测 5 只大鼠肾脏组织，与对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠肾脏组织中 Cat L 的 mRNA 表达和活性显著增高（

P

＜0.05），见表2。

2.3 Cat L 拮抗剂减轻了糖尿病大鼠的肾功能损伤

相比于正常对照组，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白和血尿素氮水平在第4周显著增高（

P

＜0.05），Cat L拮抗剂处理抑制了糖尿病引起的尿量增加。而在第8周，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白和血尿素氮、血肌酐水平均高于对照组大鼠（

P

＜0.05），Cat L 拮抗剂处理抑制了这一改变（

P

＜0.05）。见表3。

表1 每两周测定两组大鼠血糖和体质量比较∕

表2 两组大鼠 4周、8周肾脏组织中组织蛋白酶 L（Cat L）mRNA 表达和活性比较∕

2.4 抑制 Cat L 对糖尿病大鼠肾组织中炎性因子水平的影响

糖尿病模型建立后 4周，与正常对照大鼠相比，糖尿病组大鼠肾组织中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平升高（

P

＜0.05），Cat L 拮抗剂抑制了糖尿病引起的 TNF-α 和 IL-1 增加（

P

＜0.05）。在第8周，糖尿病肾组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平高于对照组（

P

＜0.05），且 Cat L 拮抗剂抑制了糖尿病引起的 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平升高（

P

＜0.05）。见表4。

2.5 抑制 Cat L 对糖尿病大鼠肾组织氧化应激指标的影响

STZ 注射后 4周，相比与对照组，糖尿病组大鼠肾组织中丙二醛水平增高，SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低（

P

＜0.05）；Cat L 拮抗剂处理组大鼠肾组织中 SOD、GSH-Px 水平较糖尿病组升高（

P

＜0.05）。在第8周，糖尿病组丙二醛水平增高，SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低（

P

＜0.05），而 Cat L 拮抗剂处理抑制了这些改变（

P

＜0.05）。见表5。

3 讨论

糖尿病肾病是导致终末肾衰竭的重要原因。而高糖介导的氧化应激和炎症反应在糖尿病肾病发展过程中起到关键作用。Cat L 是一种重要的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，很多研究报道 Cat L 与肾脏疾病的发生发展密切相关。本研究使用 Cat L 拮抗剂以明确 Cat L 对糖尿病大鼠肾脏炎症反应和氧化应激的影响。

表3 三组大鼠 4周、8周尿量、尿蛋白和血尿素氮、血肌酐水平比较

表4 三组大鼠 4周、8周肾组织中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平比较∕（ng∕L

表5 三组大鼠 4周、8周肾组织丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）和谷胱甘肽含量的比较

实验期间每两周测定 1 次大鼠血糖和体质量，我们发现糖尿病大鼠的血糖显著高于对照组、体质量明显低于对照组，证明糖尿病模型制备成功。然后，我们检测了正常大鼠和糖尿病大鼠肾脏组织中的 Cat L 表达和活性，发现高糖可导致 Cat L mRNA高表达且活性增加，提示 Cat L 与糖尿病肾病的发生发展可能存在某种关联。

糖尿病可使肾小球滤过功能障碍，导致尿量和尿蛋白含量增加。此外，血尿素氮和血肌酐也可反映肾脏功能。我们的实验发现，伴随着肾脏组织 Cat L 高表达，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白含量和血尿素氮、血肌酐水平均升高，而 Cat L 抑制了这一现象，表明 Cat L 介导了糖尿病肾功能损伤的发生。

高血糖可触发机体的炎症反应和氧化应激，导致细胞死亡。有效抑制糖尿病病人的炎症和氧化应激反应可减轻高糖引起的组织损伤。本研究发现，糖尿病肾组织中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α水平增高，而 Cat L 阻断剂抑制了高糖引起的肾脏炎性因子水平增高，提示 Cat L 可促进糖尿病肾脏炎症反应的发生。SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽是体内重要的抗氧化剂，参与氧自由基的清除。自由基可攻击生物膜，使膜脂质过氧化导致丙二醛水平升高。我们的结果表明拮抗 Cat L 抑制了糖尿病引起的肾组织 SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低和丙二醛水平升高，表明 Cat L 可介导糖尿病肾脏氧化应激的发生。

综上所述，Cat L 可促进糖尿病大鼠肾脏炎症反应和氧化应激的发生，进而引起肾功能损伤。我们的研究为糖尿病肾病的防治提供了新的参考数据。但 Cat L 介导炎症反应和氧化应激的机制还需进一步深入探索。