肺腺癌EGFR基因突变与Ki67、P53蛋白水平的相关性研究

张芳，杨宝军，王婧华

（平煤神马医疗集团总医院 病理科，河南 平顶山467009）

肺癌是目前临床死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌约占全部肺癌的80%以上，而在非小细胞肺癌中，肺腺癌最为常见，是医学界研究热点。肺腺癌临床表现无明显特异性，但具有独特分子学特征。表皮生长因子受体（EGFR）是一种原癌基因C－erbB－1表达产物，其异常表达及基因突变与肿瘤侵袭和转移、化疗抗性、新生血管生成及预后密切相关［1］。在免疫表型方面，肺腺癌具有一些特异分子标记物，Ki67属于肿瘤增殖相关抗原，参与肿瘤细胞增殖及调控；而P53蛋白是肿瘤细胞生长周期负调节因子，与细胞DNA修复、周期调控、细胞分化和凋亡等生物学功能相关，具有广谱肿瘤抑制作用和反式激活功能［2］。基于此，本研究选取我院收治的肺腺癌患者160例，分析肺腺癌EGFR基因突变与Ki67、P53蛋白水平的相关性，旨在为临床治疗及预后评估提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年7月至2019年6月我院收治的160例肺腺癌患者作为研究对象。纳入标准：病理均诊断为肺腺癌；确诊前未接受放化疗；患者及家属知情并签署同意书。排除标准：心肝肾等脏器功能异常；合并其他恶性肿瘤；确诊前接受靶分子治疗；精神系统或神经系统疾病；难以配合检查。其中男86例，女74例；年龄30～81岁，平均年龄（58.96±7.11）岁；分化程度：低分化54例，中分化58例，高分化48例。检测肺腺癌EGFR基因突变情况，根据检测结果将其分为EGFR阳性组和EGFR阴性组各80例。两组的性别、年龄、分化程度等一般资料比较无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因19、21位点突变检测 采用EGFR基因突变检测试剂盒（批号20170202H，海吉利生物有限公司），采用Taq man－ARMS法检测EGFR基因19、21位点突变情况，EGFR基因19、21位点突变为阳性，无基因突变为阴性。

1.2.2 Ki67、P53蛋白表达检测 实验步骤如下：（A）常规HE染色实验：常规石蜡标本切片，切片厚度＜3μm；干烤箱内100℃烤片固定40 min；切片室温静置60 min，并在二甲苯内浸泡2次，10 min／次，依次于浓度100%、95%、85%、75%、50%乙醇内浸泡5 min，采用蒸馏水孵育5 min后PBS缓冲液孵育5 min；苏木素染色5 min，再用自来水冲洗2 min；分化液分化，2次振荡，停留15 s后再次用自来水流水洗涤；流水冲洗返蓝，冲洗时间2 min；伊红染色，振荡3下；不同浓度酒精脱水，5 min／次；风干，中性树胶封固，采用显微镜观察。（B）免疫组化法：石蜡标本切片，切片厚度＜3μm；切片室温静置60 min，二甲苯内浸泡2次，10 min／次，依次于浓度100%、95%、85%、75%、50%乙醇内浸泡5 min，蒸馏水孵育5 min后PBS缓冲液孵育5 min；滴加3%H2O2，采用湿盒孵育10 min，清洗；PBS缓冲液再次浸泡，共3次，5 min／次；切片置入柠檬酸缓冲液，连同容器置于高压锅内加热至沸腾，维持8 min，后自然降至室温；PBS缓冲液浸泡2次，5 min／次；滴加已稀释的一抗，4℃过夜，PBS缓冲液冲洗2次，10 min／次；滴加二抗，室温孵育30 min，PBS缓冲液冲洗2次，10 min／次；滴加新鲜DAB工作液，采用湿盒孵育，显微镜下观察染色程度，控制反应时间，判断染色结束后，缓冲液浸泡3次，5 min／次；苏木素复染3 min，冲洗多余染液；1%盐酸酒精浸泡数秒，清洗切片；不同浓度酒精脱水，5 min／次，置入二甲苯浸泡，10 min／次，共2次；擦去多余液体，中性树胶固定，盖玻片封片，显微镜下观察。（C）Ki67、P53蛋白结果判读：阳性：细胞核呈棕黄色，根据细胞核染色程度分为1分（淡黄色）、2分（棕黄色和黄色）、3分（棕黑色）；根据染色细胞所占同类细胞数比例：＜10%为0分，10%～30%为1分，31%～70%为2分，＞70%为3分。Ki67蛋白：≥3分为高表达，＜3分为低表达；P53蛋白：≥3分为高表达，＜3分为低表达。

1.3 观察指标①观察两组的Ki67、P53蛋白水平；②分析EGFR基因突变与Ki67、P53蛋白水平的相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件处理数据。计数资料以n（%）表示，行χ2检验；采用Pearson法进行相关性分析；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的Ki67、P53蛋白水平比较Ki67阳性表达定位于细胞核，P53阳性表达定位于细胞浆和细胞核，EGFR阳性组的Ki67、P53高表达率分别为48.75%、52.50%，高于EGFR阴性组的21.25%、25.00%（P＜0.05）。见表1。

表1 两组的Ki67、P53蛋白水平比较［n（%）］

2.2 相关性分析Pearson相关性分析显示，EGFR基因突变与Ki67蛋白表达呈正相关（r＝0.148，P＝0.002），与P53蛋白表达呈正相关（r＝0.121，P＝0.001）。

3 讨论

肺腺癌是全球范围内发病率和死亡率均极高的恶性肿瘤之一［3］。EGFR属于受体型酪氨酸激酶erbB／HER家族成员，与其配体结合后，可造成受体自身磷酸化，活化PI3／AKT、RAS／MAPK及磷脂酶C－γ信号转导通路，参与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭及肿瘤血管形成等过程［4］。相关研究［5］表明，肺腺癌发生、进展与EGFR位点基因突变密切相关，并影响临床治疗方案制定及预后效果。目前，针对EGFR基因突变肺腺癌患者，临床采用EGFR酪氨酸酶抑制剂治疗，可显著延长生存期，表明EGFR基因突变属于肺腺癌进展驱动因子［6］。Ki67蛋白是分布于增殖细胞中的非组蛋白性核抗原，在人增殖细胞G1、G2、S、M期表达，G0期低表达或无表达，其表达程度可反映肿瘤增殖率，在多数恶性肿瘤进展期，Ki67呈高表达［7］。P53蛋白是细胞生长周期中的一种负调节因子，与细胞分化、细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复等重要生物学功能相关，通常认为P53过表达与肿瘤复发、转移、浸润及不良预后有一定关联［8］。本研究结果显示，EGFR阳性组的Ki67、P53高表达率与EGFR阴性组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Ki67、P53蛋白水平与EGFR基因突变呈正相关（P＜0.05），表明判断Ki67、P53表达能评估EGFR基因突变状况，对临床治疗肺腺癌及预后评估具有重要作用。

综上所述，肺腺癌EGFR基因突变与Ki67、P53蛋白水平具有相关性，Ki67、P53蛋白表达能够有效评估肺腺癌基因突变程度、增殖活性及预后效果，为临床治疗及预后评估提供一定的依据。