土壤解磷菌RQ3-01的筛选及初步鉴定

赵咏梅, 李婷雨, 阮 倩

(西安文理学院 生物与环境工程学院，西安 710065)

植物的生长发育和光合作用都离不开磷元素，磷是植物体内有机化合物的主要成分，是植物生长必需的营养元素之一。植物中的磷主要来源于土壤，然而，土壤中大部分的磷与Ca2+,Fe2+,Fe3+,Al3+结合形成难溶性磷酸盐，致使植物无法直接利用[1]。据报道，我国有75%的耕地土壤缺磷，并且95%以上的磷为无效形式，在农业生产中就极易导致化肥过量施用，并且磷肥的当季利用率仅为5%至25%，这使得土壤营养失调，土壤品质性质退化，农作物产量降低，形成恶性循环。近年来，利用植物根际与磷循环相关的生物学系统来调节植物根际磷的有效性，特别是利用解磷微生物来活化土壤难溶性磷，已成提高土壤磷的有效性研究热点。土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物，能够将难溶性的磷酸盐如磷矿粉转化为水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，从而改善植物磷素营养，提高作物产量[2]。所以，从土壤中分离具有解磷功效的菌株制备成微生物肥料，提高土壤对磷的利用率，具有重要的意义。笔者研究了从土壤中提取鉴定解磷菌株的过程，为开发新型微生物肥料提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样本材料 西安文理学院附近地表以下10 cm取土样各100 g，混匀，烘干，保藏于实验室备用。

1.1.2 仪器 荧光显微镜(OLYMPUS-CX31)、超净工作台、电子天平、立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX-40Ⅱ型)、隔水式电热恒温培养箱(PYX-OHS-40X-0)、分光光度计、数显恒温水浴振荡器(SHA-C)及常规实验用具。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备 营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH7.2-7.4，灭菌备用。

无机磷培养基：葡萄糖10 g，琼脂20 g，NaCl 0.3 g，MgSO40.3 g，KCl0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)212 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，(NH4)2SO40.5 g，加蒸馏水至1 000 mL,pH7.2，灭菌备用。

有机磷液体培养基(蒙金娜培养基)(g·L-1)：葡萄糖10.00 g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，CaCO35 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH7.0～7.5，灭菌。将培养基融化冷却至50°C后，立即加入蛋黄液(蛋黄液为0.8%无菌生理盐水与鸡蛋黄1∶1配制)，每100 mL的基础培养基加卵黄稀释液3～4 mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝固。

1.2.2 菌种的初筛和纯化 称取10 g土样过100目筛，置入90 mL无菌水中，于室温摇床上100 rpm摇动30 min,得10倍稀释悬液；稀释制备10-3，10-5倍土壤悬液；用无菌管分别吸取10，10-1，10-3，10-5倍稀释土壤悬液各0.1 mL，置于无机磷平板培养基，在30℃下培养3～7 d后，对产生了溶磷圈的单菌落进行分离纯化；镜检并编号，4℃保藏备用。

1.2.3 透明圈法菌种的复筛 将初筛出来的菌株接种于无机磷固体培养基平板，置于28℃培养3 d，将产生透明圈的菌株用直尺测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，并根据是否产生溶磷圈以及D/d值得大小确定菌株的解磷能力。

1.2.4 钼锑抗比色法测定RQ3-01菌株可溶性磷含量 将RQ3-01菌株以3%～6%的接种量接入150 mL液体磷发酵培养基，以空白种子液为对照，置于30℃、180 rpm培养5～7 d；再制备钼锑贮存溶液、钼锑抗显色剂、5 mg·L-1磷标准溶液备用；按照钼锑抗比色法绘制磷标准曲线。对RQ3-01菌株的可溶性磷含量进行测定，以空白种子参比液调节仪器零点，进行比色测定，读取OD700nm吸光度,计算含量[3]。

1.2.5 RQ3-01菌株的形态学和生化鉴定 将筛选出来的菌株RQ3-01在营养琼脂培养基上培养，观察菌落生长特征，记录其形状、大小、颜色、透明度、边缘特征等[4]；常规方法进行革兰氏染色，吖啶橙染色；直接将配置好的1%盐酸四甲基对苯二胺滴加于被检菌落上，采用菌落法进行氧化酶试验，观察菌落的变化[5～7]。

1.2.6 RQ3-01菌株的分子生物学鉴定 将RQ3-01菌株送到上海生工生物工程股份有限公司进行16SrDNA的扩增与测序。

2 结果

2.1 菌种的初筛和纯化结果

通过在无机磷培养基上培养筛选出9株解无机磷能力比较强的菌株，分别为：RQ3-01、RQ1-01、RQ1-02、RQ2-02、RQ2-03、RQ3-02、RQ3-03、RQ4-01、RQ4-02。

2.2 菌种解磷能力的复筛和鉴定

用透明圈法进行复筛，产生透明圈的菌株为解无机磷细菌，用直尺测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d),计算9株菌株的D/d值大小，结果如表1所示，RQ3-01菌株溶磷圈最大，D/d值达到1.78，故其解无机磷能力最强。

表1 透明圈法测定各种菌株的解磷能力

2.3 RQ3-01菌株的可溶性磷含量测定

用钼锑抗比色法测定RQ3-01菌株的可溶性磷含量，确定其解无机磷能力。绘制的磷标准曲线见图1和图2，得到公式y=0.5731x(R2=0.9992)，y=0.5417x(R2=0.9958)，计算出发酵液中的有效磷含量。与磷标准曲线进行对照分析可知，RQ3-01菌株解无机磷能力达到22.313 mg·L-1，有机磷能力达到：20.266 mg·L-1。

图1 无机磷标准曲线

2.4 RQ3-01菌株的形态学和生化鉴定结果

RQ3-01菌株在无机磷培养基上呈白色，黏稠状，菌落周围有透明圈，形状不规则，边缘平滑。革兰氏染色后RQ3-01菌株为红色，为革兰氏阴性菌。经过吖啶橙染色在荧光显微镜下可以观察到RQ3-01菌株为无核细菌，呈杆状，不形成芽孢，分泌黄绿色荧光色素并发出荧光。氧化酶试验中菌株由白色变为紫色，呈阳性。

图2 有机磷标准曲线

图3 RQ3-01菌株在荧光显微镜(40x)下的形态

2.5 RQ3-01菌株的分子生物学鉴定

对RQ3-01菌株进行16SrDNA的扩增和测序，检测表明其碱基对为1391bp(图4)；经核糖体数据库比对显示，RQ3-01菌株与荧光假单胞菌相似度为100%。故RQ3-01菌株是荧光假单胞菌。

图4 RQ3-01菌株的测序结果

3 讨论

土壤中的微生物是土壤肥力的核心，其不仅数量巨大，且种类极多，部分种类对土壤氮、磷和钾等养分的转化和供给起到非常重要的作用。因此，对土壤中解钾菌、解磷菌和固氮菌的研究越来越得到学者们的重视。实验经过多级筛选从土壤中分离得到荧光假单胞菌RQ3-01，其解无机磷和有机磷能力分别达到22.313 mg·L-1和20.266 mg·L-1，实验证明，RQ3-01有较强的无机和有机磷耐受力。

在已知的植物根际有益微生物中，荧光假单胞菌是种群数量较多的细菌种类之一。研究表明，荧光假单胞菌营养需要相对简单，能够利用植物根系分泌物中的营养迅速定殖，其菌剂对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有繁殖速度快，适应能力强，易于人工培养等优点，更适合现代社会对农业生产及有害生物防治的需求[8～9]。本实验分离得到的荧光假单胞菌RQ3-01，不仅本身具有繁殖速度快，适应能力强，易于人工培养等优点，且具有良好的解磷效果，但其对有机磷农药的耐受性和其遗传稳定性有待作更深入的研究。