TGF-β1/ERK5信号通路对大鼠矽肺纤维化的影响

郝雪洁，陈赫，周效宝，张步云，张安然，王瑞，张海东

1.山东省职业卫生与职业病防治研究院，山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东 济南 250062

2.青岛阜外心血管病医院，山东 青岛 266034

3.济宁市精神病防治院（济宁市职业病医院），山东 济宁 272051

4.山东第一医科大学（山东省医学科学院）基础医学院（基础医学研究所），山东 济南 250062

矽肺是尘肺中最为常见的一种类型，是由于长期吸入大量游离二氧化硅（SiO2）粉尘所引起，以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病。对于矽肺的发病机制，细胞因子学说认为，SiO2进入肺部后被肺泡巨噬细胞吞噬，巨噬细胞受到刺激，从而产生大量细胞因子，如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等，其中TGF-β1被认为是最重要的致纤维化因子，可与下游多种蛋白形成信号通路诱导尘肺病的发生［1］。因此，阻断TGF-β1与下游蛋白的联系成为研究矽肺临床治疗的一个重要途径。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族是TGF-β1 的重要下游激酶，可刺激肺纤维化的形成，细胞外信号调节激酶5（excellular signal-regulated kinase 5，ERK5）是MAPK 家族最后一个被发现的亚族，其对肺纤维化的作用少有研究，国内尚未有明确研究证明TGF-β1/ERK5 信号通路在肺纤维化中的作用，国外也仅有少量报道证明体外实验中TGF-β1/ERK5 信号通路对肺纤维化有影响［2］。本研究拟通过Disitertide 抑制大鼠体内TGF-β1 与其受体的结合，观察TGF-β1/ERK5信号通路在肺纤维化中的作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

选取SPF 级Wistar 健康雄性大鼠21 只（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司），年龄为6～7 周，体重为240～260 g，实验动物质量合格证号为37009200019540号。实验动物饲养于山东省职业卫生与职业病防治研究院SPF 屏障动物房，许可证号：SYXK（鲁）20140012，温度21～25℃，相对湿度45%～65%，昼夜交替时间为12 h/12 h，饲养期间动物自由摄食、饮水。饲养条件符合GB 14925—2010《实验动物环境及设施》有关要求。本研究经山东省职业卫生与职业病防治研究院动物伦理委员会批准（审批号：2019-16）。

1.2 主要仪器和试剂

偏振光显微镜（日本尼康有限公司），灰度分析 软件（美国Alpha Innotech 公 司），SiO2粉 尘（美国Sigma 公司），ELISA 检测试剂盒（中国武汉华美生物工程有限公司），TGF-β1 抑制剂Disitertide（美国MCE 公司），兔抗鼠丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MEKK）2、MEKK3、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶5（phospho-mitogen activated protein kinase kinase 5，P-MEK5）（英国 Abcam 公司），兔抗鼠磷酸化细胞外信号调节激酶5（phospho-excellular signal-regulated kinase 5，P-ERK5）（德国CST 公司），IRDye680RD 羊抗兔抗体（美国Li-COR 公司），BCA 蛋白定量检测试剂盒（中国武汉塞维尔生物科技公司）。

1.3 动物分组与染毒方法

大鼠适应性饲养7 d 后，随机分为对照组（7 只）、模型组（7 只）和干预组（7 只）。用质量分数为0.9%的NaCl 溶 液配制100 mg·mL-1的SiO2粉 尘（质量分 数80%，粉尘粒径为1～5 µm）悬浮液，采用一次性非暴露气管染尘法建造大鼠急性矽尘暴露模型，对照组大鼠经同样的方法气管灌注1 mL 灭菌生理盐水。造模完成24 h后，干预组大鼠腹腔注射Disitertide溶液0.8 mL（1 mg Disitertide粉末溶解于1 mL DMSO和9 mL生理盐水混合液中），模型组大鼠腹腔注射同比例溶剂0.8 mL（1 mL DMSO混合9 mL生理盐水），每3 d注射一次，共注射9 次。此染毒剂量和染毒频率的成本较低且能较好地抑制TGF-β1 表达［3］。每天观察大鼠一般情况，记录大鼠体重变化。

1.4 肺湿重称重及肺组织病理学检查

造模后28 d，各组大鼠腹腔注射体积分数为10.0%的水合氯醛溶液麻醉，以心脏取血法处死，取肺组织称重。称重后取大鼠左肺上叶同一部位制备石蜡标本，用4℃、质量分数为0.9%的氯化钠溶液冲洗后，立即置于体积分数为4.0%的多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，常规取材脱水、石蜡包埋，左肺行HE 染色、Masson染色，以3D Histech 扫描仪扫描病理切片，观察大鼠肺组织病理学改变情况。

1.5 Western blotting 法检测肺组织中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5蛋白表达

剪取大鼠右肺下叶组织100 mg 放在离心管中置于碎冰上，研磨成浆，用RIPA蛋白裂解液抽提总蛋白，通过蛋白定量试剂盒，采用Brandford 法进行蛋白定量。每个样取20 µg 在十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶中电泳、转膜。用质量分数为5%的脱脂奶粉封闭2 h 后与一抗抗体孵育过夜，第二天与二抗抗体孵育1 h 后成像。

1.6 ELISA法检测血清中TGF-β1

将血浆用离心机以3 000～3 500 r·min-1离心5 min（离心半径10 cm），取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书操作，检测细胞因子TGF-β1 水平。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验服从正态分布，以±s描述，多组间均数比较采用完全随机设计资料的方差分析，组间两两比较采用LSD-t方法。检验水准α=0.05（双侧）。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

造模后第3 天时，对照组、模型组和干预组体重差异无统计学意义（P> 0.05）；第14 天时，与对照组大鼠相比，模型组和干预组大鼠体重降低（P< 0.05），与模型组相比，干预组大鼠体重升高（P< 0.05）；第28 天时，与对照组相比，模型组和干预组大鼠体重均降低（P< 0.05）。第28天时，与对照组相比，模型组和干预组肺湿重、肺脏比升高（P< 0.05），与模型组相比，干预组肺湿重、肺脏比降低（P< 0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体重、肺湿重及肺脏比（n=7，±s）Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)

表1 各组大鼠体重、肺湿重及肺脏比（n=7，±s）Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)

［注］a：与同时间对照组比，P < 0.05；b：与同时间模型组比，P < 0.05。

组别体重/g肺湿重/g 肺脏比第3天 第14天 第28天对照组 282.29±5.71 367.86±9.56 389.29±15.78 1.65±0.10 0.42±0.03模型组 288.29±13.38 331.00±16.21a 356.29±25.23a 3.12±0.36a 0.88±0.09a干预组 281.14±9.81 350.86±15.81ab 361.14±11.78a 2.73±0.30ab 0.75±0.09ab F 1.01 11.83 6.51 52.94 71.7 P 0.386 0.001 0.007 <0.001 <0.001

2.2 大鼠肺组织HE染色结果

第28 天时，对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，组织结构正常（图1A）；模型组大鼠肺组织呈肺气肿样改变，肺泡壁增厚，肺泡腔大小不一，局部可见单核细胞聚集成团（图1B）；干预组大鼠组织肺泡壁略增厚，肺泡数较模型组增多，有轻微肺气肿样改变（图1C）。见图1。

图1 大鼠肺组织HE染色结果Figure 1 HE staining results of rat lung tissues

2.3 大鼠肺组织Masson染色结果

第28天时，对照组大鼠未见明显的蓝色胶原产生（图2A）；模型组可见蓝色胶原分布，且有明显纤维性结节产生（图2B）；干预组大鼠肺组织内有少量蓝色胶原分布，有少量且小的结节产生（图2C）。见图2。

图2 大鼠肺组织Masson染色结果Figure 2 Masson staining results of rat lung tissues

2.4 大鼠肺组织MEKK2、MEKK3、MEK5、P-ERK5蛋白表达变化

Western blotting 检测结果显示，各组大鼠肺组织中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表达水平均发生改变。与对照组相比，模型组和干预组大鼠肺组织各蛋白表达水平均升高（P< 0.05）；与模型组相比，干预组大鼠MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表达水平均降低（P< 0.05）。见图3、表2。

图3 各组大鼠肺组织中相关蛋白的表达Figure 3 Relative expression levels of target proteins in lungtissues of rats

表2 各组大鼠肺组织MEKK2、MEKK3、MEK5、P-ERK5蛋白的相对表达变化Table 2 Relative expression levels of MEKK2, MEKK3, MEK5, and P-ERK5 in lung tissues of rats

2.5 大鼠血清TGF-β1质量浓度

第28天时，对照组大鼠血清中TGF-β1表达量为（211.98±25.37）pg·mL-1，模型组为（577.02±35.43）pg·mL-1，干预组为（274.84±39.42）pg·mL-1。与对照组相比较，模型组、干预组大鼠血清TGF-β1质量浓度升高（P< 0.05），与模型组相比较，干预组大鼠血清TGF-β1 质量浓度降低（P< 0.05）。

3 讨论

本实验采用一次性非暴露式气管灌注法建立大鼠矽肺模型，通过Disitertide 抑制TGF-β1 的表达，模型组大鼠肺湿重和肺脏比较对照组升高，干预组较模型组降低，HE、Masson染色后，模型组可见纤维性结节形成，干预组较模型组结节小且少，这与高芳瑜等［4］研究结果类似，表明矽肺模型造模成功。

研究表明，SiO2进入机体后与效应因子相互作用，活化细胞因子TGF-β1，TGF-β1 作为重要的促肺纤维化调控因子，可以促进肺成纤维细胞过度增殖及细胞外基质的聚集，导致组织结构破坏，当纤维化程度加重时，TGF-β1 表达增多［5-6］。ERK5 是TGF-β1 的下游信号分子，几乎在所有细胞中都有表达，能够被一些有丝分裂原和细胞应激等刺激因素激活。例如，当生长因子、氧化或高渗透压发生变化时，细胞外信号首先刺激MEKK2/MEKK3，然后磷酸化MEK5，P-MEK5再激活ERK5，P-ERK5 从细胞质转运到细胞核，从而将信号从细胞外传递到细胞内，以活化底物［7］。Kadoya 等［2］通过体外实验研究发现TGF-β1/ERK5 信号通路对肺纤维化有促进作用，为探讨体内实验中TGF-β1/ERK5 信号通路对矽肺纤维化的影响，本实验通过Disitertide展开研究。

Disitertide 是一种肽型TGF-β1 抑制剂，用于阻断与其受体的相互作用。Yang 等［8］采用Disitertide 研究发现，miR-590 可以通过TGF-β1/磷脂酞肌醇3 激酶（phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K）/丝氨酸苏氨酸激酶（silk threonine protein kinase，Akt）信号通路的传导介导骨关节炎并调节骨细胞凋亡；He 等［9］采用Disitertide 研究发现，间充质干细胞在晚期胃癌耐药性的形成中起着重要作用，而作用于TGF-β1 信号通路可能是抑制这种化学耐药性的潜在策略。这些实验结果表明Disitertide 可以有效抑制TGF-β1 的表达，为本实验研究提供依据。

本研究TGF-β1含量测定结果显示，干预组较模型组TGF-β1表达大量减少，表明Disitertide效果较好，可达到抑制TGF-β1表达的目的。与对照组相比，模型组和干预组MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表达量均出现明显升高，提示ERK5及其相关蛋白可能与肺纤维化的进展密切相关；与模型组相比，干预组各蛋白表达均有下降，提示与Disitertide 阻断了TGF-β1/ERK5信号通路中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表达有关，结合大鼠肺部病理学观察，证明TGF-β1/ERK5信号通路对大鼠矽肺纤维化有影响，抑制TGF-β1/ERK5信号通路，可能对急性矽尘暴露导致的肺部损伤起一定的保护作用。

本实验研究发现，在大鼠矽肺纤维化进程中，抑制TGF-β1 能够抑制ERK5 等相关蛋白表达，这与Badshah 等［10］的研究结果类似；Disitertide 在抑制肺泡炎、肺纤维化、胶原纤维方面和调控TGF-β1/ERK5信号通路中各蛋白表达方面都起着显著作用，证明了抑制TGF-β1/ERK5 信号通路能够抑制矽肺纤维化，这为矽肺的临床防治提供了新的指标。在生产生活中，矽肺纤维化患者多为反复吸入游离SiO2粉尘，因而抑制TGF-β1/ERK5 信号通路对矽肺纤维化患者能发挥多少作用尚未可知，且本实验为通过抑制TGF-β1 来抑制ERK5，关于直接抑制ERK5 能否减缓矽肺纤维化尚缺乏有效实验。此研究为初步研究，若想证明临床上长期应用TGF-β1 抑制药物或ERK5 抑制药物能否延缓或减轻矽肺纤维化以及是否会引起副作用，有待进一步研究。