鸡豆黄素A通过雌激素受体抑制LPS诱导的小胶质细胞活化及其机制

刘梦晴，吴阳洋，韩俊辉，俞益桂，陈寒青，吴文宁，李维组，尹艳艳

(1.安徽医科大学基础医学院药理学教研室， 安徽 合肥 230022；2.合肥工业大学食品科学与工程学院， 安徽 合肥 230009)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球第二大衰老性神经系统疾病，其主要特征是黑质多巴胺能神经元的死亡。研究表明：雌激素受体(estrogen receptors，ERs)中多存在于中脑多巴胺系统区域的是ERβ亚型，具有保持胶质细胞数目，修复受损神经细胞的功能[1-2]。活化的小胶质细胞会导致神经炎症并参与PD的发生发展[3]，当小胶质细胞活化后，引发活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)增多，将导致神经元的变性死亡[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路参与炎性因子释放，导致一氧化氮合成酶增多并诱导NO生成，与神经退行性疾病有密切的关系[5]。鸡豆黄素A(biochanin A，Bioch A)主要见于豆科植物，如鹰嘴豆和红三叶草，属于异黄酮类植物雌激素[6]，具有抗炎，神经保护，抗细胞凋亡等多种功能[7-8]。本课题组前期探索了Bioch A与PD之间的关系，结果表明，Bioch A能够抑制氧化应激以及炎症因子释放，同时，Bioch A还可以保护AngⅡ诱导的小鼠黑质致密部DA能神经元的损伤，然而，关于Bioch A保护DA能神经元的机制仍需进一步的探讨。本文建立LPS刺激小胶质细胞活化的体外模型，研究鸡豆黄素A是否通过雌激素受体抑制LPS诱导的小胶质细胞活化及其机制。

1 材料

1.1 细胞株BV2小胶质细胞(来自中国医学科学院协和医科大学)。

1.2 药品与试剂二甲基亚砜(D2650)、脂多糖(LPS)(L4391)、雌二醇(PHR2227)、Bioch A(5.32606)、雌激素受体抑制剂、ERK抑制剂(PD098059)、p38抑制剂(SB203580)、JNK抑制剂(SP600125)购自美国Sigma公司；NO和ROS检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；小鼠TNF-α、IL-1β(12426s)和PGE2的酶联免疫吸附检测试剂盒购自美国瑞沃德公司；兔抗p-p38、iNOS、p38抗体购自美国赛信通；兔抗IgG以及鼠抗β-actin抗体(AF50001)购自中杉金桥；兔抗p-NF-κB以及NF-κB购自美国Immuno Way公司。

1.3 主要仪器恒温烘箱-DHG-9070型(上海三发科学仪器有限公司)；HB-R/O05型纯水机(惠邦净水设备有限公司)；全波长酶标仪-SpectraMax190型(美国Molecular Device公司)；恒温培养箱-HealForce100型(力康生物医疗科技有限公司)；电子天平(上海天平仪器厂)；-80 ℃超低温冰箱(海尔集团公司)；制冰机-AF100型(斯科茨曼制冰系统有限公司)。

1.4 小胶质细胞株培养将BV2细胞置于DMEM培养基中(混合液含1%的青-链霉素以及10%的FBS溶液)，将培养基放置于恒温的培养箱中进行培养，每隔2-3 d更换1次培养液，通过显微镜进行观察，当培养瓶90%以上的面积被细胞占据或瓶底被铺满时，开始细胞传代。要尽快完成细胞的复苏过程，防止细胞死亡，影响最终的实验结果。

1.5 实验分组及处理本实验将小胶质细胞分为(1)Control组；(2)LPS(10 mg·L-1)组；(3)Bioch A(5 μmol·L-1)+LPS组；(4)Bioch A(5 μmol·L-1)+ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS组；(5)ER(0.1 μmol·L-1)+LPS组；(6)ER(0.1 μmol·L-1)+ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS组；(7)ICI(0.1 μmol·L-1)+LPS组；(8)Rosup(0.1 μmol·L-1)+LPS组；(9)PD (0.02 μmol·L-1) +LPS组；(10)SP(0.01 μmol·L-1)+LPS组；(11)SB(0.02 μmol·L-1)+LPS组。加入上述药物进行2 h预处理，除Control组外，其余组加入LPS(10 mg·L-1)进行36 h孵育。

1.6 NO的测定间接测定NO含量，通过Griess法检测红色重氮化合物，取对数生长期的BV2细胞，按照方法1.5将细胞分为1-7组，于恒温箱中孵育24 h后收集每组上清。使用Griess试剂盒，按照规定的要求进行吸光度值测定，计算得到各组NO含量。

1.7 ROS检测DCFH-DA探针法检测细胞内ROS的含量。实验按照实验分组将BV2细胞分为1-8组，加药处理2 h后，除Control组，剩余的组别加入LPS(10 mg·L-1)进行36 h培养。图像采集后，通过Image-Pro Plus 6.0软件来分析，计算出不同分组的平均荧光强度。

1.8 酶联免疫吸附测定培养基中TNF-α、IL-1β和PGE2水平使用ELISA试剂盒测量。按照方法1.5将细胞分为1-7组，根据 ELISA试剂盒说明书，完成细胞上清液的收集，孵育，洗板，避光显色等操作，通过ELISA试剂盒检测PGE2、IL-1β以及TNF-α的含量。

1.9 蛋白免疫印记法在培养好的BV2细胞中加入RIPA缓冲液以溶解,蛋白质浓度通过双辛酸(BCA)测定法测定。蛋白质提取物经PAGE分离后转移到固相载体PVDF膜上，放在5%脱脂牛奶在慢速摇床上封闭并在4 ℃条件下，用一抗继续培养细胞膜过夜，当膜封闭好后，使用TBST洗涤3次，在室温下将膜与HRP结合的二抗孵育2 h，随后用TBST洗膜3次，配置ECL滴在膜上并在显影仪中曝光，图像保存，通过ImageJ软件分析灰度值。

1.10 统计学分析数据处理以及统计通过SPSS 19.0统计软件，组间比较通过单因素方差分析。

2 结果

2.1 Bioch A对LPS诱导的小胶质细胞活化后TNF-α、IL-1β、PGE2的影响结果如Fig 1所示。与Control组相比，LPS组TNF-α、IL-1β和PGE2含量明显上升(P<0.01)；与LPS组相比，Bioch A以及ER组下调了炎症因子含量(P<0.05)，ICI组无明显变化(P>0.05)；与Bioch A组相比，Bioch A+ICI组炎症因子表达上调(P<0.05)；与ER组比较，ER+ICI组同样上升了炎症因子水平(P<0.05)。结果表明，Bioch A通过雌激素受体，可以抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、PGE2表达。

Fig 1 Effects of Bioch A on levels of TNF-α, IL-1β, PGE2 in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.2 Bioch A对LPS诱导小胶质细胞活化后iNOS和NO的影响结果如Fig 2所示，与Control组相比，LPS组NO含量(P<0.01)和iNOS表达(P<0.01)显著增加；与LPS组比较，Bioch A以及ER组NO含量和iNOS的表达降低(P<0.05，P<0.01)，ICI组无明显变化(P>0.05)；与Bioch A组相比，Bioch A+ICI组上调NO和iNOS水平(P<0.05)。上述结果表明，Bioch A通过雌激素受体，可以抑制NO和iNOS表达。

Fig 2 Effects of Bioch A on NO, iNOS production in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.3 Bioch A对LPS诱导小胶质细胞活化后p47phox、gp91phox、ROS的影响结果如Fig 3所示，与Control组比较，LPS组p47phox、gp91phox和ROS水平增加(P<0.01)；与LPS组比较，Bioch A以及ER组p47phox、gp91phox、ROS水平降低(P<0.01)；而ICI组无明显变化(P>0.05)；与Bioch A组比，Bioch A+ICI组p47phox、ROS和 gp91phox的水平增加(P<0.05)。结果表明，Bioch A通过雌激素受体，可以抑制P47phox、ROS和gp91phox表达。

Fig 3 Effects of Bioch A on levels of gp91phox, p47phox, ROS in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.4 Bioch A对LPS诱导小胶质细胞活化后p-p38、p-ERK和p-JNK的影响结果如Fig 4所示，与Control组相比，LPS组升高了p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白水平(P<0.01)；与LPS组比较，Bioch A以及ER组p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白水平下调(P<0.05，P<0.01)，加入PD、SP和SB通路特异性抑制剂后，出现了明显的抑制(P<0.01)，ICI组无明显变化(P>0.05)；与Bioch A组比较，Bioch A+ICI组p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表达增多(P<0.05)；与ER组比较，ER+ICI组p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表达也增多(P<0.05，P<0.01)；上述结果表明，通过雌激素受体，Bioch A可以抑制p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达。

Fig 4 Effects of Bioch A on levels of p-ERK, p-p38, p-JNK in LPS-induced BV2 cells n=3)

2.5 Bioch A对LPS诱导小胶质细胞活化后p-NF-κB和NF-κB的影响结果如Fig 5所示，各组间NF-κB蛋白的表达水平均没有不同(P>0.05)。LPS组相较Control组，p-NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；相比LPS组，ER组以及Bioch A 组降低了p-NF-κB蛋白表达(P<0.05)，ICI组无明显变化(P>0.05)；与ER组比较，ER+ICI组上调了p-NF-κB蛋白水平(P<0.05)；与Bioch A组相比，Bioch A+ICI组p-NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；结果表明，通过雌激素受体，Bioch A可以抑制p-NF-κB蛋白表达。

Fig 5 Effects of Bioch A on levels of NF-κB, p-NF-κB in LPS-induced BV2 cells n=3)

3 讨论

研究发现，活化的小胶质细胞会诱导中枢神经系统炎症的发生，炎症反应也会导致中枢神经系统中的小胶质细胞活化。许多炎症介质和促炎因子由激活的小胶质细胞生成和分泌，包括细胞因子、蛋白酶、活性氧等，其介导的神经炎症是PD发病的重要环节[9-10]。丝裂原活化蛋白激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，当受到细胞外刺激时，能够通过处理和调节细胞特性，发挥调节细胞存活、分化、增殖和凋亡等重要作用[11]。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是一种强效致炎因子，导致细胞或动物模型中帕金森相关的病理学变化，引起中脑黑质DA能神经元变性、损伤[12-13]。本实验选用LPS造模，观察Bioch A能否通过雌激素受体抑制LPS诱导的小胶质细胞活化。

小胶质细胞受到LPS刺激，激活NADPH氧化酶引起活性氧过度释放，而ROS可参与人体细胞分化等生理活动，进而释放TNF-α、IL-1β和PGE2等促炎细胞因子从而产生神经毒性[14]。过量的炎症因子释放，导致诱导型一氧化氮合酶的增多以及NO的增加，NO介导炎性反应加重细胞损伤，在正常水平下，NO可引起血管扩张，促进血液循环，但其水平过高会加重对神经细胞的毒害作用。若一直释放有毒物质或炎性因子，最终将导致DA能神经元损伤。

雌激素在多种器官的靶点，如心血管系统、神经系统等发挥保护作用。雌激素受体是雌激素作用的关键配体，主要包括两种亚型ERα以及ERβ，在中脑DA区域中高表达的ERβ可发挥重要的神经保护作用，与以神经元损伤为主要特点的衰老性神经系统疾病有关[15]。人参皂苷Rg1通过ERβ及MAPK/ERK信号转导通路促进非淀粉样蛋白切割，发挥神经保护作用。基于此，我们本次实验也对Bioch A保护DA能神经元的机制进行进一步探讨。本实验中，通过LPS诱导小胶质细胞活化，产生ROS，增加TNF-α、IL-1β和PGE2蛋白的表达，进而激活MAPK引起神经炎症反应、细胞衰老分化等病理生理过程。而Bioch A预处理能够有效的抑制炎症因子的释放、小胶质活化以及MAPK信号通路激活。在加入雌激素受体抑制剂后，Bioch A的作用受到明显的抑制，提示Bioch A通过雌激素受体抑制小胶质细胞活化，产生神经保护作用。

综上所述，Bioch A通过雌激素受体抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，与此同时也可能直接抑制氧化应激和炎症，其机制可能与抑制MAPK信号通路有关。