超声波联合木瓜蛋白酶处理对鸡胸肉嫩度的影响

潘治利，李航天，雷萌萌，艾志录，吴阳阳，黄忠民,

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州 450002；2.农业部大宗粮食加工重点实验室，河南郑州 450002；3.河南省冷链食品工程技术研究中心，河南郑州 450002）

我国的鸡肉消费及生产居世界前列，每年都有2亿多只蛋鸡被淘汰作为食用[1]。淘汰蛋鸡肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，并且鸡肉中蛋白质的含量比例较高、氨基酸种类多、消化率高，很容易被人体吸收利用，有增强体力、强身健体的作用[2]。但是，淘汰蛋鸡的鸡胸相较鸡腿等部位，由于其纤维密度较大，从而导致其肉质老、嫩度差，在很大程度上限制了鸡肉的销量，制约了了鸡肉产业的稳定发展。因此，如何提高鸡胸肉的加工品质特性，改善其食用特性一直是禽类产业关注的问题。

嫩度是评价肉的品质中最重要的指标之一，它在很大程度上影响了消费者对其的接受程度和购买度。肉品的嫩度受很多方面的因素影响，其中肉品中结缔组织的分布及性质与肌肉蛋白质分子之间的相互作用力、肌原纤维蛋白的结构和状态是影响肌肉嫩度的主要因素[3]。目前国内外运用于肉制品嫩化的方式主要分为三类：运用电刺激、超高压[4]、滚揉、超声波[5]等方法引起肉制品产生一些物理效应而达到嫩化效果的物理嫩化法；通过添加钠盐、磷酸盐、钙盐等改变肉制品内部盐离子的浓度及分布达到嫩化效果的化学嫩化法；以及通过添加木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、猪胰酶等的外源酶及蛋白酶激活剂从而达到嫩化效果的生物嫩化法。

外源酶作为一种方法简单高效[6]且无毒无害的嫩化方法，被广泛的应用于肉制品加工之中。其中从木瓜乳胶中提取出来的木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶，具有较高的稳定性，对动植物中的蛋白质、多肽类、酯类、酰胺类物质等都有着较好的水解能力[7−8]，且能有效的破坏肉的肌纤维蛋白和结缔组织[9]，是最常用的植物蛋白酶之一。李培红等[10]通过正交实验研究发现木瓜蛋白酶对猪脯肉的嫩化效果要优于复合磷酸盐的嫩化效果。周珠法[11]通过响应面法优化了木瓜蛋白酶嫩化牛肉的工艺，确定最佳牛肉嫩化条件为：酶浓度0.07%，pH6.9，处理温度60 ℃,处理时间1.8 h。赵立等[12]以剪切力为评价指标，采用单因素实验和响应面优化实验对木瓜蛋白酶嫩化鸭肉的工艺进行了优化得出了鸭肉在使用木瓜蛋白酶嫩化时的最佳嫩化工艺条件。陶瑞[13]等发现，木瓜蛋白酶使用量过大会导致肉的外观和组织严重破坏，失水过多，肉块变硬，风味异常。

超声波是一种频率高于20 kHz的机械波[14]，有着穿透力强、实用性好的优点，在鲜肉及鲜肉制品加工中受到了极大的关注。超声波所产生的“空化效应”可以在不破坏肉制品的质量的情况下，通过肌肉组织内部的强烈反应改变肉制品的理化性质和加工性能[15]，从而可以达到一定的嫩化效果。Dickens等[16]，通过使用频率为40 kHz，功率为2400 W的超声波对鸡胸肉进行了15 min处理，发现经超声波处理后的鸡胸肉的剪切力显著降低（P<0.05)。Xiong等[17]研究了发现超声波联合碳酸氢钠辅助腌制和碳酸氢钠辅助腌制处理对肉质嫩度、持水性和腌制效率的改善作用均大于传统湿式腌制，且超声波联合碳酸氢钠辅助腌制效果最佳。而在牦牛肉[18]、鸭肉[19]、羊肉[20]、牛肉[21]等肉制品中，都存在超声波辅助嫩化的研究。

目前，采用单一方法处理来提高肉类嫩度的研究比较多，且都产生了较好的效果，但是针对鸡胸肉采用多方法复合处理对嫩度影响的研究较少。本文以鸡胸肉为原料，通过超声波联合木瓜蛋白酶处理鸡胸肉，采用响应面的方法进行分析，以剪切力为响应值，研究超声波联合木瓜蛋白酶处理对鸡胸肉剪切力的影响，优化其工艺参数，为超声波联合木瓜蛋白酶处理嫩化鸡胸肉技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

去皮淘汰蛋鸡鸡胸肉 购于郑州双汇食品有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g） 南宁庞博生物工程有限公司。

TA-XT2i物性分析仪 英国SMS公司；J3000型电子天平 常州市双杰测试仪器厂；HVC-410F/2A-G型单室真空包装机 浙江华联机械集团有限公司；SCIENTZ-IIDM型微波光波超声波萃取仪宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料与处理 将鸡胸肉从−40 ℃冰箱里取出至4 ℃冰箱解冻24 h后，剔除可见脂肪和结缔组织后洗去血污，然后将清洗干净的鸡胸肉切成5 cm×3 cm×3 cm大小、形状均匀的肉块（50±3） g。

配制pH7.0的磷酸盐缓冲液，将木瓜蛋白酶分别稀释成不同的浓度，放于4 ℃冰箱中冷藏备用。酶的活力采用酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行测定[22]。

1.2.2 嫩化处理 将切好的均匀肉块中分别用注射器在不同位置均匀注射不同浓度的木瓜蛋白酶溶液，使蛋白酶溶液均匀分布于肉块之中，然后将含有相同浓度木瓜蛋白酶的肉块放在一起进行真空封口，分别置于超声仪器中进行后续嫩化处理。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同功率超声波处理鸡胸肉 固定木瓜蛋白酶浓度为200 U/g，超声波时间为30 min，（工作3 s，间歇3 s），超声频率为20 kHz，超声温度为30 ℃，分别采用功率为0、200、400、600、800、1000 W的超声波对鸡胸肉进行嫩化处理。

1.2.3.2 不同浓度木瓜蛋白酶处理鸡胸肉 固定超声功率为400 W，超声频率为20 kHz，超声时间为30 min（工作3 s，间歇3 s），超声温度为30 ℃，分别采用浓度为0 U/g（等量蒸馏水注射），100、150、200、250和300 U/g的木瓜蛋白酶溶液对鸡胸肉进行嫩化处理。

1.2.3.3 不同超声时间处理鸡胸肉 固定木瓜蛋白酶浓度为200 U/g，超声波功率为400 W，超声频率为20 kHz，超声温度为30 ℃，分别对鸡胸肉进行时间为0 min（只使用200 U/g的木瓜蛋白酶处理），10、20、30、40和50 min的超声波嫩化处理。

1.2.3.4 不同超声温度处理鸡胸肉 固定木瓜蛋白酶浓度为200 U/g，超声波功率为400 W，超声时间为30 min，超声频率为20 kHz，分别采用温度为20、30、40、50、60 ℃的超声波对鸡胸肉进行嫩化处理。

1.2.4 响应面优化试验设计 运用 Box-Behnken中心试验设计原理，筛选木瓜蛋白酶用量、超声波功率和超声时间三个变量作为主要因素，以剪切力作为响应值，进行三因素三水平响应面设计试验，响应面因素设计如表1。

1.2.5 剪切力测定 将嫩化后的肉样置于80 ℃水浴锅中水浴加热，待肉的中心温度达到75 ℃时继续水浴30 min后，取出肉样待冷却至25 ℃后，用滤纸擦干肉样表面水分，将样品沿肌纤维方向切割成长×宽×高=2 cm×1 cm×1 cm的长方体小块，取样后立即置于TA-XT2i物性分析仪上进行测定。测定条件：探头型号为 WBS 探头，测试前速度为2 mm/s，测试中速度为1 mm/s，测试后速度为2 mm/s，测试距离为 30 cm，初始激发力为10 g。平行测定6次取平均值。

1.3 数据处理

用Excel、Word 和SPSS 24对数据进行整理后采用Duncan检验进行多重比较分析，数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。利用Design-Expert 10.0.4软件进行响应曲面设计及数据分析。采用Origin 9.1进行制图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 超声波功率对鸡胸肉嫩化效果的影响 如图1所示，随着超声波功率的增加，鸡胸肉的剪切力在400 W之前明显降低，在400 W时剪切力为1551.42 g，与未经超声处理及经过200 W超声处理的鸡胸肉的剪切力之间存在显著性差异（P<0.05），同时，超声波功率大于400 W之后剪切力略微升高，但与400 W处理效果差异不显著（P>0.05），超声功率1000 W时剪切力为1669.74 g，与未超声处理之间差异显著。这可能是因为超声波处理效果存在一定的阈值，当超声功率大于阈值时，其产生的物理效应所达到的效果也随之减弱，此研究结果与付萧逸等[23]研究结果一致。黄六容等[24]研究发现木瓜蛋白酶经过一定功率的超声处理一定时间后，其催化的反应更容易进行，但是当超声功率过高时，会导致木瓜蛋白酶活性降低甚至失活。因此，选择超声功率为400 W进行后续实验。

图1 超声波功率对鸡胸肉剪切力的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on the shear force of chicken breast

2.1.2 木瓜蛋白酶浓度对鸡胸肉嫩化效果的影响如图2所示，随着木瓜蛋白酶浓度的升高，鸡胸肉的剪切力随之降低，在木瓜蛋白酶浓度为200 U/g时剪切力最低为1522.44 g，且与对照组用蒸馏水处理之间存在显著差异。这是因为木瓜蛋白酶在超声波的作用下能在鸡胸肉内部快速扩散，水解肌原纤维蛋白，肌肉结构变得松散，致使鸡胸肉剪切力显著下降。周丹[25]等研究发现超声波处理对肌纤维蛋白产生机械物理破坏作用，同时其空化作用使线粒体、肌质网和溶酶体膜破坏，加快木瓜蛋白酶溶液的扩散和渗透,提高嫩化效果。同时本实验在使用木瓜蛋白酶浓度大于200 U/g后随着木瓜蛋白酶浓度的增加鸡肉的剪切力略微上升，并且在使用木瓜蛋白酶的浓度大于250 U/g后鸡肉出现过度嫩化的现象，肉色发黄，在一定程度上破坏了鸡胸肉的感官品质，因此选择木瓜蛋白酶浓度为200 U/g进行后续实验。

图2 木瓜蛋白酶浓度对鸡胸肉剪切力的影响Fig.2 Effects of papain concentration on the shear force of chicken breast

2.1.3 超声时间对鸡胸肉嫩化效果的影响 如图3所示，在其他条件不变的前提下，随着超声时间的增加鸡胸肉的剪切力随之逐渐减少，且在经超声处理30 min与只使用木瓜蛋白酶处理相比剪切力变化显著，说明在一定处理时间内，超声波处理能够有效的改善鸡胸肉的剪切力，而在经过超声处理30 min之后剪切力随时间减少趋势的降低，且差异不显著，并且随着在30 min之后随着超声波处理的时间增加，整个反应体系的温度会稍微上升。因此在超声处理50 min时剪切力虽然达到最小值1543.26 g，但是与超声处理30 min时剪切力1522.44 g之间差异不显著（P>0.05）。而在日常生产中要尽量减少产品损耗及提高效率，因此选择超声处理30 min来进行后续实验。

图3 超声处理时间对鸡胸肉剪切力的影响Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on the shear force of chicken breast

2.1.4 超声温度对鸡胸肉嫩化效果的影响 如图4所示，随着超声处理温度的升高，剪切力逐渐降低，在50 ℃时剪切力最低1600.38 g，但是由于超声波所产生的机械波在震荡过程中会产生一些能量，由超声波产生的热能会使得整个反应体系的温度升高，从而使得真正的反应温度并不是仪器所设定的温度，且30～50 ℃鸡胸肉剪切力值之间差异并不显著（P>0.05)。白鸽[26]等通过实验发现随着超声温度的增大，木瓜蛋白酶的相对酶活呈现先增大后减小的趋势,并在40 ℃处达到最大值,相对酶活为166.56%。并且温度过高的话可能会导致酶的活性降低甚至失活，因此选用温度更容易控制的40 ℃进行后续实验。

图4 超声处理温度对鸡胸肉剪切力的影响Fig.4 Effects of ultrasonic treatment temperature on the shear force of chicken breast

通过上述实验结果可以看出，超声波产生的机械波所引发的空化效应能够改变鸡胸肉的一些理化性质，在一定程度上改善酶的活性，从而使肉样嫩化。这与Barekat等[27]采用高强度超声波联合木瓜蛋白酶对牛肉进行嫩化，研究结果一致。

2.2 响应面优化试验结果及分析

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验结果，超声波联合木瓜蛋白酶能很好的降低鸡胸肉的剪切力，从而达到一定的嫩化效果。但是由于超声处理温度不宜过高，通过单因素实验确定超声处理的温度为40 ℃。进而采用响应面Box-Behnken设计试验，以鸡胸肉的剪切力响应值，考察木瓜蛋白酶浓度（A）、超声时间（B）、超声功率（C）对鸡胸肉嫩度的影响，优化试验结果见表2。

表2 响应面试验因素水平设计及试验结果Table 2 Level design and test results of response surface test factors

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 采用Desgin-Expert 10.0.4程序对实验数据采用最小二乘法进行二次多项式回归拟合，得到在超声波联合木瓜蛋白酶处理嫩化鸡胸肉工艺中剪切力（Y）与木瓜蛋白酶浓度（A）、超声时间（B）、超声功率（C）三个因素之间的二元回归方程为：剪切力（Y）=1465.13−62.73A+15.30B−46.66C−40.80AB+46.41AC+33.66BC+121.18A2+61.00B2+154.33C2。由表3可以看出，回归模型的P<0.0001，说明该预测模型极显著。失拟项的P>0.05差异不显著，说明实验误差较小。该模型的拟合系数R2=0.9880，矫正拟合系数R2Adj=0.9725，说明在实验设计的范围内，该模型能较好地表达鸡胸肉剪切力值与木瓜蛋白酶浓度（A）、超声时间（B）、超声功率（C）三个因素之间的关系。对于各个因素对剪切力的影响中，木瓜蛋白酶浓度（A）和超声波功率（C）对模型的影响极显著（P<0.01），超声波时间（B）对模型的影响不显著（P>0.05），且由F值可以看出各因素的影响大小为：木瓜蛋白酶浓度（A）>超声功率（C）> 超声时间（B）。交互项中AB（木瓜蛋白酶浓度和超声时间）项、AC（木瓜蛋白酶浓度和超声波功率）项影响极显著（P<0.01），BC（超声波时间和超声功率）项影响显著（P<0.05），平方项A2、B2、C2影响极显著（P<0.01）。各交互项之间的影响大小为：AC>AB>BC，二次项影响大小为C2>A2>B2。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

2.2.3 响应面中各因素间交互作用分析 超声波联合木瓜蛋白酶处理嫩化鸡胸肉各因素之间的交互作用的响应面曲线如图5～图7所示，可以看出AB，AC，BC两因素交互作用的响应曲面均呈明显的凹陷状态。并且可以看出当两个因素不变时，另外一个因素可以明显的使剪切力值先降低后上升，说明三个因素对鸡胸肉剪切力的影响显著；从凹陷程度可以看出AC交互项的凹陷程度大于AB交互项的凹陷程度大于BC交互项的凹陷程度，即交互作用AC>AB>BC，此结果与从表3得出的结果一致。

图5 木瓜蛋白酶浓度和超声时间对鸡胸肉剪切力影响的响应曲面Fig.5 Response surface of papain concentration and ultrasonic time on the shear force of chicken breast

图6 木瓜蛋白酶浓度和超声功率对鸡胸肉剪切力影响的响应曲面Fig.6 Response surface of papain concentration and ultrasonic power on chicken breast shear

图7 超声时间和超声功率对鸡胸肉剪切力影响的响应曲面Fig.7 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic power on the shear force of chicken breast

2.2.4 最佳工艺参数的确定及验证 通过Desgin-Expert 10.0.4软件分析，可得到最优的工艺参数为：木瓜蛋白酶浓度211 U/g，超声时间29 min，超声功率425 W此时剪切力的预测值为1454.52 g。为了操作方便可行，将工艺条件优化为：木瓜蛋白酶浓度200 U/g，超声时间30 min，超声功率425 W，在此基础上进行验证实验剪切力为1537.14 g。与预测值相接近，且与未经过嫩化的鸡胸肉（剪切力为2625.48 g）相比剪切力降低了41.45%，与仅用木瓜蛋白酶嫩化的鸡胸肉（剪切力为1982.88 g）相比剪切力降低了22.48%，与仅用超声波处理嫩化的鸡胸肉（剪切力为1898.22 g）相比剪切力降低了19.02%，证明该优化结果有效可用。

3 结论

本文通过单因素试验和响应面法对超声波联合木瓜蛋白酶嫩化鸡胸肉的工艺条件进行了优化，得到超声波联合木瓜蛋白酶嫩化鸡胸肉工艺的最佳工艺参数为：木瓜蛋白酶浓度200 U/g，超声时间30 min，超声功率425 W，在此基础上进行验证实验剪切力为1537.14 g，与模型所预测值相近。优化结果与未经处理的鸡胸肉剪切力相比降低了41.45%，与单独使用木瓜蛋白酶和超声波处理的鸡胸肉剪切力分别降低了22.48%和19.02%，说明该优化结果有效。超声波联合木瓜蛋白酶可以高效安全的成为嫩化鸡胸肉的一种方法。