基于网络药理学和分子对接的葛根-灵芝-当归干预抗氧化机制研究

向 福，艾勇泉，徐俊伟，余时敏，方元平

(1.经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000；2. 黄冈师范学院 李时珍大健康研究院，湖北 黄冈 438000；3. 湖北省中科产业技术研究院，湖北 黄冈 438000)

抗氧化是指抗氧化自由基的简称。人体在与外界接触时，受自身的呼吸(氧化)和外界环境因素的影响，体内会不断地产生自由基[1]。一般来说，人体内自由基数目处于动态的消长平衡过程，对人体不会造成伤害，但平衡被打破时，大量的自由基就会氧化损伤机体细胞，从而引发各种疾病[2]，动脉粥样硬化、糖尿病、风湿性关节炎、癌症及衰老过程等疾病的发生与自由基密切相关[3]。

中药作为一种天然的抗氧化剂应用广泛，大量研究表明，中药有效成分可以通过调节和增强机体特异性及非特异性免疫功能，能抑制自由基的产生或直接作用于自由基对细胞及组织的损伤部位[4]。但中药成分复杂，目前关于中药的药理研究主要集中于药效评价，对于其作用机制的深入研究仍较少[5]。

黄冈大别山地区特色植物资源丰富，中药材种植面积达110万亩。葛根、灵芝和当归均为大别山地区主要药物植物，其中葛根含有葛根异黄酮、葛根素等活性成分，二者均具有较强的抗缺氧和抗氧化作用[6]；灵芝含有多糖、三萜酸类和生物碱等多种物质，具有多种生物活性、毒性小，是理想的抗氧化剂[7]；当归含有多糖、挥发油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。但三味中药在抗氧化作用机制方面研究较少，因此，本研究基于网络药理学和分子对接技术，揭示葛根-灵芝-当归复方抗氧化作用机制，以期为深入研究抗氧化药理作用机制，为大别山地区葛根、灵芝、当归等特色药材资源利用和临床应用提供证据和方向。

1 材料与方法

1.1 葛根-灵芝-当归主要活性成分筛选

通过中药系统药理分析平台TCMSP数据库[9]，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug-Likeness，DL)≥0.18为筛选条件，检索葛根-灵芝-当归中的三味中药活性成分。

1.2 活性成分靶点和疾病靶点筛选

利用TCMSP数据库检索活性成分对应靶点，并结合UniProt数据库查询靶点对应的基因名，规范靶点蛋白[10]。利用GeneCards数据库以“anti-oxidant”为关键词检索，获取抗氧化的相关靶点，与葛根-灵芝-当归活性成分对应的靶点取交集，获得葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在靶点。

1.3 构建葛根-灵芝-当归活性成分-靶点网络

利用Cytoscape软件构建活性成分-靶点网络，根据各个节点的中心度值(Degree)、介度(Betweeness Centrality)等数据，分析活性成分和靶点。

1.4 构建葛根-灵芝-当归PPI网络图和频次分布图

将干预抗氧化的潜在靶点导入STRING数据库，物种选择“Homo sapiens”，设置蛋白互作综合得分>0.7，其余参数不变，隐藏游离靶点，得到PPI网络图，下载其TSV文件格式，导入Cytoscpe绘制蛋白相互作用网络图，对超过平均度值的靶蛋白进行频次分析。

1.5 潜在靶点的GO功能及KEGG通路富集分析

将葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在靶点导入DAVID数据库，得到生物过程、细胞成分、分子功能和KEGG通路数据[11-12]，以P<0.05为筛选条件，选取排名前20的条目绘制图形进行可视化分析。

1.6 分子对接

选择1.3中突出的前5种活性成分作为小分子，进行加氢、加电荷处理，选择1.3和1.4交互的核心靶点作为靶点蛋白，从PDB数据库下载靶点文件。利用Autodock软件对蛋白进行去水、加氢、加电荷处理，并进行小分子与蛋白对接处理，获取对接能量，通过PyMOL软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 葛根-灵芝-当归主要活性成分筛选

通过TCMSP数据库，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，共寻找到67种活性成分：灵芝61种(灵芝活性成分过多，只列出突出的4种成分)、葛根4种及当归2种活性成分(表1)。葛根中葛根素(puerarin)的OB值虽小于30%，但DL值为0.69，且其功效突出，故将其计入其中，所以共计68种活性成分，有效成分β-谷甾醇(β-sitosterol)为三种中药共有活性成分，故考虑此活性成分为葛根-灵芝-当归复方干预抗氧化的主要活性成分。

表1 葛根-灵芝-当归复方部分活性成分表

2.2 葛根-灵芝-当归和抗氧化靶点筛选

通过TCMSP数据库查询葛根-灵芝-当归68种活性成分对应的靶点，删除重复值共得到109个靶点，并结合UniProt数据库查询靶点对应的基因名，规范靶点蛋白。

通过GeneCards数据库以“anti-oxidation”为关键词对其检索，共得到982个靶点，根据药物活性成分靶点和抗氧化靶点，绘制韦恩图，共得到56个重复靶点，即为葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在靶点(图1)。

图1 葛根-灵芝-当归和抗氧化靶点韦恩图

2.3 构建成分-靶点网络图

将葛根-灵芝-当归筛选得到的主要活性成分和潜在干预抗氧化的靶点导入Cytoscape软件建立成分-靶点网络(图2)，其中“KYH”表示葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在靶点，“FF”表示葛根-灵芝-当归复方活性成分。度值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，成分度值越大说明该成分越重要。在与潜在靶点相互作用的活性成分中，Degree大于平均值的活性成分有5种，分别是β-谷甾醇、葛根素、刺芒柄花素(formononetin)、3'-甲氧基大豆黄素(3'-methoxydaidzein)、豆甾醇(stigmasterol)，Degree大于平均值的靶点有PTGS2、PTGS1、JUN、BCL2、CASP8、PPARG等。从图2可知，一个成分对应多个靶点，同时多个成分也对应着一个靶点，表明葛根-灵芝-当归是多成分、多靶点共同干预抗氧化。

图2 葛根-灵芝-当归活性成分和干预抗氧化潜在靶点网络图

2.4 葛根-灵芝-当归PPI网络构建

将葛根-灵芝-当归和抗氧化共同靶点导入STRING数据库，结果信息导入Cytoscpe进行分析，共得到52个节点(去除4个游离的节点)，227条边，如图3所示。节点越大、颜色越深，表明对其靶点调控的活性成分越多。由图2中Degree≥8的AKT1、STAT3、JUN、TNF、VEGFA、PTGS2等19个靶点，绘制图4所示频次分布图，其中图3涉及的靶点包含成分-靶点网络中主要靶点，两图的主要靶点相互关联，推测葛根-灵芝-当归可能通过JUN、CASP8、PPARG、CASP3、PTGS2等靶点作用于抗氧化。

图3 葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在靶点PPI网络图

图4 葛根-灵芝-当归与抗氧化共同靶点频次分布

2.5 潜在靶点的GO功能和KEGG富集分析

将葛根-灵芝-当归干预抗氧化的潜在56个靶点导入David数据库，进行GO(Gene ontology)分析和KEGG(KEGG pathway analysis)代谢通路富集分析。GO分析结果(图5)显示，生物过程中主要包括对药物的反应(response to drug)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、老化(aging)等；由细胞成分可推测这些靶点主要集中在胞质溶胶(cytosol)、细胞质(cytoplasm)、核质(nucleoplasm)等；分子功能主要集中于相同的蛋白质结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)、转录因子结合(transcription factor binding)等。KEGG通路分析结果表明，主要通路集中于癌症的途径(Pathways in cancer)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、细胞凋亡(Apoptosis)等(图6)。因此，葛根-灵芝-当归可能通过老化、凋亡过程的负调控、抗缺氧的反应等方式对氧化起着抑制作用，从而干预抗氧化。

图5 靶点的GO富集分析：生物过程，细胞成分，分子功能

图6 靶点的 KEGG 富集分析图

2.6 分子对接分析

为了验证网络药理学预测葛根-灵芝-当归三味中药活性成分抗氧化作用靶点的可靠性，采用分子对接方法从理论上对与排名靠前的靶点的结合能力进行了验证，结果见表2，三味中药部分活性成分可与JUN、CASP3、CASP8、PPARG靶点发生结合，其结合自由能均小于0 kJ/mol，表明突出成分与上述靶点具有较强的结合力，且三味中药突出成分β-谷甾醇、刺芒柄花素、3'-甲氧基大豆黄素、豆甾醇与靶点间的结合能均存在小于-5 kJ/mol的情况，表明突出活性成分和核心靶点间有较大的结合能力，葛根-灵芝-当归复方部分活性成分与靶点的分子对接复合体可视化结果见图7。

表2 葛根-灵芝-当归部分活性成分与突出靶点分子对接结果

图7 葛根-灵芝-当归部分活性成分与靶点的分子对接复合体

3 讨论

《素问百·至真要大论》记载“君一臣二，度制之小也”。《神农本草经》所记载上、中、下三品之药，分别为君、臣与佐使，功能各有不同[13]。葛根，《神农本草经》将其列为中品，葛根含有葛根异黄酮成分、葛根素等活性成分，研究表明，二者均具有较强的抗缺氧和抗氧化作用[6]。灵芝，《神农本草经》将其列为上品，含有多糖、三萜酸类和生物碱类等多种物质具有多种生物活性，毒性小，是理想的抗氧化剂[7]。当归，《神农本草经》将其列为中品，发现其含有多糖、挥发油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。以灵芝为君药，葛根和当归为臣药组成的一君二臣复方是一种小剂量复方，在抗氧化方面具有一定作用。

3.1 多成分-多靶点干预抗氧化

葛根-灵芝-当归可能通过调控JUN、CASP3、CASP8、PPARG等靶点抑制抗氧化。其中JUN是组成转录因子AP-1的重要亚基，可以负调控TP53的表达，从而参与调控机体氧化还原反应[18]。PPARG可直接调控与氧化应激相关基因的表达，以应对机体氧化应激损伤，既可促进抗氧化基因表达，也可抑制促氧化基因表达[19]。CASP3和CASP8在细胞凋亡过程中起重要作用，其中CASP3当细胞受到损伤时，其主要表现为线粒体膜损伤，线粒体内的细胞色素释放到细胞外，激活CASP3从而诱导细胞凋亡，从而延缓衰老[20]。

3.2 多通路干预抗氧化

葛根-灵芝-当归和抗氧化的56个潜在靶点在“Pathways in cancer”、“TNF signaling pathway”和“Apoptosis”通路富集程度较高，三者涉及的共同靶点为CASP3、AKT1、FOS、PIK3CG。CASP3可以诱导细胞凋亡，从而延缓衰老[20]，AKT1参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，是参与氧化应激的主要激酶[21]。FOS和PIK3CG等基因也多在由自由基引起的动脉粥样硬化和癌症等疾病中表达，参与疾病的调控。因此当机体发生氧化作用时，可能通过以上通路中的靶点作用来干预抗氧化。

综上所述，基于网络药理学和分子对接技术发现，葛根-灵芝-当归能通过多成分、多靶点、多通路的作用模式来干预抗氧化。但是，中药复方的使用并不是各味中药有效成分简单的叠加，且目前对于中药活性成分的研究仍存在不足，使得该类技术仍存在一定的局限性。