miR-214-5p靶向SEMA4C基因调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和侵袭的分子机制

董宝铁 李泓 高伟 周振东

类风湿性关节炎(RA)是一种侵蚀软骨和骨的慢性炎症性自身免疫性疾病，确切发病机制目前尚不明确，是一个致残率较高的疾病，其主要病理特征是滑膜炎，RA滑膜成纤维细胞(RA-FLSs)是RA滑膜增生和侵袭的主要效应细胞，也是治疗的靶细胞[1]。有研究表明，在大鼠RA模型细胞中注射miRNA模拟物或siRNA，可减轻RA大鼠关节肿胀和关节炎指数，抑制RA-FLSs增殖和炎性反应[2]。有研究表明，与无RA的间质性肺病(ILD)患者相比，miR-214-5p在RA相关的ILD患者中表达上调[3]。miR-214-5p在前列腺癌和胰腺癌中表达均下调，与癌细胞的增殖、迁移和侵袭相关[4,5]。starBase预测发现，SEMA4C与miR-214-5p存在互补的位点。SEMA4C在结直肠癌中表达上调，可导致癌细胞的侵袭和迁移率的增加[6]。SEMA4C在RA中的表达及其与miR-214-5p的关系目前尚不清楚。本研究以RA患者关节置换术取出的滑膜组织中分离培养的RA-FLSs为研究对象，假设miR-214-5p靶向SEMA4C影响RA-FLSs细胞增殖和侵袭，并对此进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料 人类风湿性关节炎滑膜组织取自我院行关节置换术的RA患者；告知患者其滑膜组织的用途，与患者签署知情同意书，RA患者的临床诊断特征均符合美国风湿病学会标准。

1.2 试剂与仪器 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基(美国Gibco公司)，牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)和胰蛋白酶Trypsin(美国Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(美国Corning公司)；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(美国Promega公司)；Lipofectamine 2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)(美国Invitrogen公司)；SEMA4C抑制剂(si-SEMA4C)、SEMA4C过表达载体pcDNA-SEMA4C、miR-214-5p的模拟物(miR-214-5p)、miR-214-5p的干扰物(anti-miR-214-5p)、阴性对照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC、pcDNA-NC)和引物购自上海吉玛制药有限公司；CCK8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白检测试剂盒(Thermo)；SEMA4C、CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗体和β-actin抗体(美国Santa cruz公司)；全自动酶标仪及Real-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:清洗从RA患者关节置换术取出的滑膜组织，用无菌剪剪碎，然后在0.25%胰酶中37℃消化2 h，离心收集细胞，即RA-FLSs细胞，将细胞培养在含10% FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基中，于37℃ 5% CO2培养箱中培养。消化传代，实验选用第3～8代细胞。

1.3.2 细胞转染:将对数生长期的RA-FLSs细胞稀释至1×106个/ml，以2×105个细胞/孔接种于6孔板中，细胞培养至基本融合为一层时按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。转染分组：miR-NC组、miR-214-5p组、si-NC组、si-SEMA4C组、anti-miR-NC组、anti-miR-214-5p组、miR-214-5p+pcDNA-NC组和miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C组。转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.3 Real-time PCR检测miR-214-5p和SEMA4C mRNA的表达:收集RA-FLSs细胞，用试剂盒提取总RNA，保存于-80℃。然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为16℃ 30 min、42℃ 40 min、72℃ 5 min；4℃放置10 min，于-80℃保存。取cDNA按照 Real-time PCR的说明书进行反应，反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 45 s、60℃ 50 s、72℃ 45 s，40个循环；72℃10 min。引物如下：miR-214-5p 上 游：5’-TCTCTTGCTATAGAAGCACAAC-3’，下游：5’-TCCTCCACAATCATGCTGTGT-3’；SEMA4C上游：5’-ACCTTGTGCCGCGTAAGACAG-3’，下游：5’-CGTCAGCGTCAGTGTCAGGAA-3’。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.3.4 Western Blot实验:收集对数生长期的RA-FLSs细胞，裂解细胞，收集蛋白并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样本进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入稀释的一抗SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9，4℃过夜孵育。洗膜，加入500倍稀释的二抗，室温孵育2 h。以β-actin为内参照，分析蛋白水平。

1.3.5 CCK8实验检测细胞活性:收集转染后的RA-FLSs细胞，胰蛋白酶消化细胞，稀释细胞，以2×103个细胞/孔(100 μl)接种于96微孔板中，继续48 h，进行 CCK8实验，每孔加入10 μl CCK8溶液，继续培养2 h，酶标仪测定450 nm 处的吸光度(A)值。细胞增殖率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.3.6 Transwell实验测定细胞侵袭:将Matrigel置4℃过夜融化，以4℃无血清DMEM培养基1∶6比例稀释Matrigel，取100 μl均匀铺满上层Transwell小室，37℃固化3 h，Transwell上层小室加入100 μl RA-FLSs细胞(2×106个/ml)，下层小室加入500 μl 20%FBS培养基，培养24 h，冰甲醛固定侵袭细胞，0.1%结晶紫染色，显微镜观察计数。

1.3.7 双荧光素酶报告实验:根据方法1.3.2进行转染，将构建SEMA4C的野生型(WT-SEMA4C)和突变型(MUT-SEMA4C)双荧光素酶报告载体，分别于miR-NC或miR-214-5p共转染RA-FLSs，转染48 h，收集细胞，裂解细胞，收集细胞上清，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

2 结果

2.1 RA-FLSs中miR-214-5p和SEMA4C的表达 qRT-PCR和Western Blot结果表明，与对照组比较，RA-FLSs组中miR-214-5p的含量下降，SEMA4C mRNA和蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

表1 miR-214-5p和SEMA4C在RA-FLSs中的表达情况

图1 Western Blot检测SEMA4C蛋白表达

2.2 高表达miR-214-5p对RA-FLSs细胞增殖和侵袭的影响 qRT-PCR结果表明，与miR-NC组比较，miR-214-5p组的miR-214-5p表达量显著上升(P<0.05)。CCK8和Transwell实验结果表明，与miR-NC组比较，miR-214-5p组的RA-FLSs细胞增殖率和侵袭细胞数均显著下降，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明上调miR-214-5p可抑制RA-FLSs的增殖和侵袭。见表2，图2。

表2 高表达miR-214-5p对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和侵袭的影响

图2 Western Blot检测CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达

2.3 低表达SEMA4C对RA-FLSs细胞增殖和侵袭的影响 Western Blot、CCK8和Transwell实验结果显示，与si-NC组比较，si-SEMA4C组SEMA4C表达水平降低，RA-FLSs细胞增殖率和侵袭细胞数均下降，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明低表达SEMA4C可以抑制RA-FLSs细胞增殖和侵袭。见图3，表3。

图3 Western Blot检测SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达

表3 低表达SEMA4C对RA-FLSs增殖和侵袭的影响

2.4 miR-214-5p靶向SEMA4C starBase数据库预测结果显示，SEMA4C的3’-UTR序列中含有与miR-214-5p互补的位点。双荧光素酶报告系统结果显示，与miR-NC组比较，miR-214-5p组野生型WT-SEMA4C的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)；而突变型MUT-SEMA4C的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化(P>0.05)。Western Blot结果表明，与miR-NC组比较，miR-214-5p组的SEMA4C蛋白水平下降(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-214-5p组的SEMA4C蛋白水平上升(P<0.05)。见图4，表4、5。

图4 miR-214-5p靶向调控SEMA4C表达;A starbase对miR-214-5p和SEMA4C结合进行预测示意图；B Western Blot检测SEMA4C表达量

表4 miR-NC或miR-214-5p与报告质粒共转染RA-FLSs细胞后双荧光素酶活性检测

表5 Western Blot检测SEMA4C的表达

2.5 高表达SEMA4C可以逆转miR-214-5p对RA-FLSs增殖和侵袭的影响 Western Blot、CCK8和Transwell结果显示，与miR-214-5p+pcDNA-NC组比较，miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C组RA-FLSs细胞中SEMA4C表达水平增高，RA-FLSs细胞增殖率和侵袭细胞数均增高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明高表达SEMA4C逆转了上调miR-214-5p对RA-FLSs细胞增殖和侵袭的抑制作用。见图5，表6。

图5 Western Blot检测SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达

表6 高表达SEMA4C可以逆转miR-214-5p对RA-FLSs增殖和侵袭的影响

3 讨论

近年来，使用有效的生物制剂和新药物的靶向治疗方法极大改善了RA患者痛苦[7]。研究证实，RA-FLSs的表观遗传学改变(DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达)在关节炎症和损伤中起重要作用[8]。许多miRNAs在RA患者的细胞、组织和体液中的表达也发生了改变，miRNA类似物或拮抗剂已被用作实验性关节炎模型的治疗方案，并显示出良好的效果，为RA患者提供了发现新的靶向药物的机会[9]。但仍有部分miRNA在RA-FLSs增殖及凋亡中的作用机制尚未完全阐明。

研究表明，miR-214在强直性关节炎中和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的RA患者T细胞中均呈现低表达[10,11]，且miR-214的过表达逆转了TNF-α介导的RA-T细胞凋亡，抑制了细胞内ERK和JNK的磷酸化。miR-214-5p在RA-FLSs的表达和具体作用尚不清楚。本研究结果表明，与对照组比较，miR-214-5p在RA-FLSs中表达量显著下调，提示miR-214-5p在RA-FLSs中可能发挥重要调控作用。本研究结果显示高表达miR-214-5p可抑制RA-FLSs细胞增殖和侵袭，抑制CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达，研究表明CyclinD1可正向调控细胞周期，并可与CDK4结合形成复合物从而促进细胞增殖[12]。基质金属蛋白酶与肿瘤细胞迁移及侵袭密切相关，MMP2、MMP9属于基质金属蛋白酶类并可促进细胞迁移及侵袭[13]。本研究结果提示miR-214-5p过表达可抑制RA-FLSs细胞增殖及侵袭，从而在RA-FLSs中发挥重要调控作用。

此外，通过starBase数据库预测发现，SEMA4C的3’-UTR序列中含有与miR-214-5p互补的核苷酸序列，预示两者间存在结合位点。本研究假设miR-214-5p可靶向SEMA4C调控RA-FLSs的增殖和侵袭。SEMA4C又叫信号素分子4C，SEMA4C在喉鳞状细胞癌组织、乳腺浸润性导管癌组织、宫颈癌和骨肉瘤中均表达上调，与癌细胞的EMT、转移及预后有关，是多个miRNA的靶点，发挥癌基因的作用[14-17]。SEMA4C在RA-FLSs细胞中表达尚不清楚。本研究证实，SEMA4C在RA-FLSs中的表达量升高，低表达SEMA4C基因可显著抑制RA-FLSs细胞增殖和侵袭。双荧光素酶报告系统结果发现，miR-214-5p靶向负调控SEMA4C蛋白表达，提示miR-214-5p可能通过负向调控SEMA4C的表达从而影响RA-FLSs细胞增殖及侵袭。为探究miR-214-5p是否可通过调控SEMA4C的表达而发挥作用，本研究将miR-214-5p mimics与pcDNA-SEMA4C共转染至RA-FLSs细胞中，SEMA4C的表达水平增高，RA-FLSs细胞增殖率和侵袭细胞数均增高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水升高，说明高表达SEMA4C逆转了上调miR-214-5p对RA-FLSs细胞增殖和侵袭的抑制作用，两者在RA-FLSs细胞中存在调控关系。提示miR-214-5p可能通过调控SEMA4C表达从而影响RA-FLSs细胞增殖及侵袭。

综上所述，在RA-FLSs细胞中，miR-214-5p下调，SEMA4C基因上调，miR-214-5p通过靶向SEMA4C调控RA-FLSs细胞增殖和侵袭。miR-214-5p有望成为RA诊断和治疗新的靶标。