星点设计-效应面法优化栀子苷脂质体制备工艺*

曹娟，侯雪芹，王福刚

[山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院，泰安 271016]

栀子苷是从茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的成熟果实中提取的活性成分[1]，具有保肝[2]、解热[3]、抗炎镇痛[4]、抗氧化[5]及抗肿瘤[6]等药理作用。研究表明，栀子苷水溶性较强，口服吸收差，所以生物利用度比较低，从而影响其药效的发挥[7]。将栀子苷制备成脂质体，使其分散于脂质体双分子层中，可显著提高其在胃肠道的稳定性，增加生物利用度，增强临床疗效[8]。

脂质体是一种脂质双分子层组成的内部为水相的球状囊泡，主要构建原料为磷脂和胆固醇，可分别包裹水溶性和脂溶性药物于磷脂双分子层和水相中，载药范围广，可明显改善药物的理化性质，能有效提高药物生物利用度[11]。近年来，星点设计-效应面优化法在制剂工艺筛选中被广泛应用[9-11]，与常用的正交设计方法相比，其实验结果准确度高、数学模型预测值与真实值更接近[12]。因此，笔者在单因素实验基础上，结合星点设计-效应面法优化栀子苷脂质体的制备工艺，为其制剂学研究和应用提供实验依据，然后用激光粒度仪对栀子苷脂质体的平均粒径和多分散指数(PDI)值进行测定；并采用高效液相色谱(HPLC)法对脂质体中栀子苷的含量测定方法进行考察，报道如下。

1 仪器与材料

1.1仪器 SPD-10Avp 型高效液相色谱仪(岛津公司)；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(上海予申仪器有限公司)；Sizer Nano ZS90型激光粒度分析仪 (英国Malvern公司)； AB135-S梅特勒-托利多电子天平(瑞士梅特勒仪器公司，感量：0.01/0.1 mg)；UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.2材料 栀子苷对照品(天津西玛科技有限公司，批号：110749-201718)；栀子苷原料药(质量分数>95%，陕西慈缘生物技术有限公司)；胆固醇(上海源叶生物科技有限公司，批号：S11040)、大豆卵磷脂(上海源叶生物科技有限公司，批号：S30869)；色谱纯甲醇和乙腈(美国Fisher 公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1栀子苷脂质体的制备 采用薄膜分散法制备脂质体。精密称取磷脂200 mg，胆固醇50 mg，置于250 mL圆底烧瓶中，加入适量三氯甲烷超声溶解，于50 ℃恒温水浴条件下减压蒸发，使其在烧瓶内壁上形成均匀的类脂膜。称取栀子苷10 mg，加入 pH值6.8的磷酸盐缓冲溶液30 mL；然后将磷酸盐溶液加入圆底烧瓶，常压旋转水化1 h后，于冰水浴中超声，即得栀子苷脂质体。

2.2栀子苷含量测定方法的建立

2.2.1色谱条件与系统适应性实验 色谱柱：Diamonsil plus C18( 4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(15：85)；流速为1.0 mL·min-1；进样量为20 μL；检测波长为 238 nm；柱温为30 ℃。理论板数按栀子苷峰计算>6000，分离度符合规定。

2.2.2栀子苷对照品溶液的配制 精密称取栀子苷对照品4.01 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度，得到401 μg·mL-1的栀子苷对照品溶液。

2.2.3栀子苷标准曲线的制备 精密吸取栀子苷对照品溶液，用甲醇进行梯度稀释，得到质量浓度为0.80，1.60，3.20，4.81，8.01 μg·mL-1对照品溶液，HPLC法测定峰面积。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，回归方程为：Y=149 999X-5 876.1，r=0.999 4。结果表明，栀子苷在0.80～8.01 μg·mL-1范围内，浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.4精密度实验 分别精密吸取高、中、低浓度栀子苷对照品溶液(8.01，4.81，1.60 μg·mL-1)，分别进样6 次，进样20 μL，测定峰面积，计算日内精密度。栀子苷低、中、高3种浓度RSD分别为1.06%，0.47%，0.56%，说明本方法精密度良好。

2.2.5重复性实验 精密吸取栀子苷脂质体混悬液，用甲醇破乳，稀释成4.81 μg·mL-1溶液6份，进样20 μL，测定峰面积，计算脂质体中栀子苷的量，其RSD为0.95%，说明本方法重复性良好。

2.2.6回收率实验 精密吸取栀子苷脂质体混悬液(用甲醇稀释成4.81 μg·mL-1)1 mL，分别加入高、中、低浓度栀子苷对照品溶液(8.01，4.81，1.60 μg·mL-1)1 mL，然后加入甲醇破乳超声，进样20 μL，测定峰面积(每个浓度3份)。结果高、中、低3种浓度回收率分别为99.84%，99.75%，100.04%，RSD分别为1.25%，0.87%，0.73%(n=3)。

2.2.7稳定性实验 精密吸取栀子苷脂质体混悬液，用甲醇稀释成4.81 μg·mL-1溶液，分别于 0，2，4，6，8，10，12 h，进样20 μL，HPLC法测定峰面积。结果RSD 为1.24%，表明样品在12 h内稳定性良好。

2.3包封率的测定 精密吸取栀子苷脂质体2 mL，加入10 mL量瓶中，加入甲醇定容，并超声破乳，用孔径0.22 μm微孔滤膜滤过，按照“2.2.1”项色谱条件进行测定药物总量(C总)。精密吸取栀子苷脂质体2 mL，置于透析袋内，于20 mL纯水中透析12 h，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定栀子苷含量(C游)。包封率(%)=(1-C游/C总)×100%，C游为游离栀子苷质量浓度，C总为栀子苷中质量浓度。载药量(%)=Wd/Wp，Wd为脂质体中的药物质量，Wp为脂质体的总质量。

2.4单因素考察

2.4.1成膜温度的考察 按“2.1”项条件制备脂质体，设定成膜温度分别为40，50，60 ℃，磷脂与胆固醇比、脂药比和水化溶剂用量等不变，并计算包封率。实验结果表明，按以上温度制备的栀子苷脂质体包封率分别为75.08%，84.69%，74.16%。根据实验结果，确定成膜温度为50 ℃。

2.4.2磷脂与胆固醇比例的考察 按“2.1”项条件制备脂质体，设定磷脂与胆固醇比分别为1：1，4：1，7：1，磷脂与胆固醇比、脂药比和水化溶剂用量等不变。按以上比例制备的栀子苷脂质体包封率分别为52.84%，80.25%，82.09%。根据实验结果，说明选用不同的磷脂与胆固醇比例会明显影响脂质体包封率。

2.4.3脂药比的考察 按“2.1”项条件制备脂质体，设定脂药比(磷脂胆固醇之和与栀子苷比)分别为10：1，25：1，40：1，磷脂与胆固醇比、脂药比和水化溶剂用量等不变。按以上比例制备的栀子苷脂质体包封率分别为52.85%，84.10%，78.64%。根据实验结果，脂药比对脂质体包封率的影响较为显著。

2.4.4水化溶剂用量的考察 按“2.1”项条件制备脂质体，设定水化溶剂用量分别为20，30，40 mL，磷脂与胆固醇比、脂药比和水化溶剂用量等不变，栀子苷脂质体包封率分别为67.82%，84.10%，80.61%。说明水化溶剂容量对脂质体的包封率影响较为显著。

2.4.5水化溶剂pH值的考察 按“2.1”项条件制备脂质体，设定水化溶剂的pH值分别为6.5，6.8，7.2，其磷脂与胆固醇比、脂药比和水化溶剂用量等不变，栀子苷脂质体包封率分别为75.02%，82.10%，81.03%。根据实验结果，确定水化溶剂的pH值为6.8。

2.5星点设计优化处方和制备工艺

2.5.1星点实验设计 根据单因素考察的实验结果，选择对包封率影响较大的脂药比、磷脂与胆固醇比、水化溶剂用量作为考察对象，采取三因素、五水平的星点设计-效应面优化法，筛选最佳处方。结合单因素实验结果确定自变量范围：脂药比(A)10：1～40：1、磷脂与胆固醇比(B)1：1～7：1、水化溶剂用量(C)20～40 mL，因素水平见表1。实验设计表及结果见表2。

表1 星点设计-效应面的因素与水平

表2 星点设计-效应面法优化处方组成

2.5.2模型拟合 根据实验结果，选用Design-Expert 8.0.6.1版软件，分别以包封率和载药量为因变量对各因素进行二次多项式拟合。结果包封率(%)=86.47+2.27A+2.49B+1.44C+1.17AB+0.54AC-0.062BC-2.98A2-2.40B2-2.38C2(P<0.000 1，R2=0.9436)；载药量(%)=4.21+0.19A+0.27B+0.073C+0.19AB+0.075AC-0.057BC-0.22A2-0.13B2-0.15C2(P=0.000 8，R2=0.895 1)。

对2个模型的回归参数进行方差分析，结果见表3、表4。对于包封率，模型P<0.000 1，具有极显著性；A、B、C、A2、B2、C2极显著，其他项不显著。对于载药量，模型P=0.000 8，具有极显著性差异；A、B、A2极显著，AB、B2、C2显著，其他项不显著。

表3 响应面模型对包封率的方差分析结果

表4 响应面模型对载药量的方差分析结果

2.5.3效应面分析 选用Design-Expert 8.0.6.1版软件，依据所拟合的数学模型，分别绘制评价指标对2个考察因素的三维效应面图，另外一个因素置为中心点值，结果见图1、图2。

图1 各种因素对包封率的响应曲面图

图2 各因素对载药量的响应曲面图

由图1、图2可知，随着这3个因素的增大，包封率和载药量均呈先增大后减小的趋势，包封率和载药量的影响大小均为磷脂与胆固醇比>脂药比>水化溶剂用量，水化溶剂用量与磷脂与胆固醇比两者交互作用对OD值影响不明显。

2.5.4效应面预测与验证 根据软件预测结果，再结合实际实验数据，选取栀子苷脂质体的最佳处方为：脂药比32：1、磷脂与胆固醇比6：1和水化溶剂用量32 mL。包封率和载药量预测值分别为87.45%，4.54%。按上述优选出来的处方条件重复进行3次实验。结果包封率的平均值为87.8%，RSD为1.8%(n=3)，与预测值相对误差为1.48%。载药量平均值为4.48%，RSD为1.6%(n=3)，与预测值相对误差为1.32%。

2.6栀子苷脂质体的质量评价

2.6.1脂质体的形态 取适量按最佳处方所制备的栀子苷脂质体混悬液，加适当纯化水稀释，滴加在铜网上，用1%磷钨酸染色2 min，待铜网干燥后，用透射电镜(TEM)观察并拍摄照片，结果见图3。栀子苷脂质体呈乳白色，质地较稀，置于4 ℃环境中24 h，脂质体混悬液稳定。由图3可知脂质体分布均匀，形态完整，以球形为主。

图3 栀子苷脂质体TEM图

2.6.2粒径及点位的考察 室温条件下，取适量栀子苷脂质体加入PBS液稀释，用纳米激光粒度仪测定其粒径分布及Zeta电位。粒径分布见图4。结果表明，栀子苷脂质体平均粒径为157.0 nm，粒径较小，可以促进吸收；峰形为单峰；多分散系数(PDI)值为0.234，说明脂质体粒径分布比较均匀；Zeta电位为-28.7 mV，说明脂质体比较稳定。

图4 栀子苷脂质体粒径分布

3 讨论

本实验采用薄膜分散法制备脂质体，制备过程中需要注意成膜温度，若温度过高，容易导致磷脂变性，过低则容易析出沉淀。溶剂的选择也非常关键，选用甲醇作为溶剂时，对卵磷脂的溶解性差，成膜效果不理想；溶剂为乙醚时，药物溶解速度较慢。最终选用三氯甲烷为溶剂，药物溶解较好，成膜较为理想。

本实验采用薄膜分散法制备栀子苷脂质体，以包封率和载药量为考察指标，对影响脂质体性能较大的脂药比、磷脂与胆固醇比例、水化溶剂用量3个指标采用星点设计-效应面法进行优化，模型对于自变量与因变量的拟合效果较好，预测栀子苷脂质体的制备工艺稳定可行。确定最佳制备工艺为：脂药比32：1，大豆卵磷脂与胆固醇质量比6：1，水化溶剂用量32 mL。所得脂质体粒径为(157.0±6.4) nm，包封率(87.8±1.68)%，载药量(4.48±2.58)%。本研究可为栀子苷脂质体的进一步临床应用奠定良好的基础。