醒脾解郁汤对七氟醚麻醉后老年小鼠记忆功能的影响*

高源，李秀菊，赵雪，宗传赪，王领

(武汉市第八医院麻醉科，武汉 430010)

七氟醚是一种临床常用吸入性全身麻醉药物，具有诱导快、苏醒迅速、理化性质稳定等优点，但临床研究却发现七氟醚可导致患者，尤其是老年患者出现术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)，其主要表现为麻醉术后出现记忆力减退、执行力受损、定向力障碍以及抽象思维障碍等，对患者术后康复以及生活质量产生严重影响[1-2]。七氟醚引起POCD发生的相关机制尚未明确，临床上也缺乏有效的防治手段。醒脾解郁汤由石菖蒲、西洋参、熟地黄、郁金等常用于治疗认知障碍的中药制成[3-4]，前期研究发现醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠认知功能障碍和神经元损伤具有较好的缓解作用[5]，提示醒脾解郁汤在认知障碍相关疾病中具有较大的潜在价值。笔者在本实验通过观察醒脾解郁汤对七氟醚麻醉后老年小鼠的学习记忆行为和细胞炎性因子水平的影响，探讨醒脾解郁汤影响术后认知功能障碍的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级C57BL/6J小鼠40只，18个月龄，雌雄各半，体质量30～35 g，由湖北省疾病预防控制中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0019；动物质量合格证号：NO.42816300002591。动物实验操作均严格遵循动物福利与伦理准则和指南的相关规定，所有小鼠于温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h的环境中适应性喂养1周后开始实验。

1.2试药 石菖蒲(批号：20161103)、西洋参(批号：20161101)、郁金(批号：20161102)和熟地黄(批号：20161101)购自湖北天济中药饮片有限公司。醒脾解郁汤组成[6]：取石菖蒲10 g，西洋参15 g，郁金12 g和熟地黄15 g放入容器中，加水并淹没至药材上1 cm处，浸泡30 min，先武火煮至沸腾，再文火煮30 min后倒出，即制成生药含量为0.26 g·mL-1的醒脾解郁汤。七氟醚(上海恒瑞医药有限公司，批号：H20160706)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和一氧化氮(NO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号分别为：A003-1、A001-1、A005、A013-2)。白细胞介素(IL)-17A、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自贝茵莱公司(货号分别为MU30386、MU30009、MU30044、MU30030)。兔抗caspase 3多克隆抗体、兔抗Bax单克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体均购自Abcam公司(货号分别为ab4051、ab182733、ab196495)；兔抗GAPDH多克隆抗体购自Proteintech公司(货号：10494-1-AP)。

1.3仪器 酶标仪(北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602)；电泳仪(Bio-Rad公司，型号：mini protean 3 cell)；全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司，型号：Tanon-5200)。

1.4动物分组、给药 将小鼠按照数字随机数字表法分为正常对照组，模型对照组，醒脾解郁汤小、中和大剂量组，每组8只。正常对照组小鼠吸入氧气(30%)和氮气(70%)的混合气体6 h；模型对照组小鼠吸入2.6%七氟醚、30%氧气和67.4%氮气的混合气体6 h；醒脾解郁汤小、中和大剂量组小鼠于七氟醚处理前6 d开始至处理后第2天，每天灌服醒脾解郁汤3.6，7.2，14.4 g·kg-1·d-1。

1.5水迷宫实验 参照文献[7]。训练期前检测各组小鼠游泳速度以及逃逸潜伏期，各组间小鼠无明显差异情况下进行水迷宫训练。所有小鼠于吸入气体前6 d开始进行水迷宫训练，每日4次。每次将小鼠面向池壁入水，令其寻找置于第Ⅰ象限水面下1 cm处平台，所耗时间记为逃逸潜伏期。本实验设定最大时限为90 s(即在90 s内未找到平台者停止记录，并将逃逸潜伏期记为90 s)。七氟醚处理后第2天撤去平台，选取原平台正对象限为动物入水点，让动物自由游泳90 s，记录90 s内动物穿过平台区的次数，并记录逃逸潜伏期和在原平台停留的时间。水迷宫测定完毕后，立即腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg·kg-1，麻醉小鼠后迅速处死，收集各组小鼠脑组织样本，分离海马及大脑皮层，保存于-80 ℃中备用。

1.6氧化应激指标检测 将收集的海马及大脑皮层组织剪碎，按照1：5比例加入组织样本和预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰上进行匀浆，5000 r·min-1离心5 min(有效离心半径为85 mm)，取上清液检测SOD、MDA及GSH-PX表达变化，生化实验检测NO含量，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.7炎症因子检测 取小鼠海马及大脑皮质组织，匀浆上清液，ELISA检测各组小鼠海马和大脑皮质中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的表达。具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.8Western blotting检测 取各组小鼠海马组织，采用RIPA裂解液提取组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，每孔上样蛋白样品30 μL，采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行凝胶电泳分离后，转印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，使用5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h，经TBST洗涤后分别加入一抗(Bax、Bcl-2和caspase-3)，4 ℃孵育过夜；TBST再次洗涤后，加入特异性二抗IgG，进行室温孵育1 h，洗膜，电致化学发光(ECL)试剂对其曝光显影，拍照保存。

2 结果

2.1小鼠记忆功能的影响 水迷宫训练前，各组小鼠游泳速度及逃逸潜伏期比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。水迷宫测试结果见表2，与正常对照组比较，模型对照组小鼠逃逸潜伏期明显延长，小鼠穿越平台次数及在该象限停留的时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，醒脾解郁汤小、中、大剂量组逃逸潜伏期显著缩短，小鼠穿越平台的次数和在该象限停留时间延长，醒脾解郁汤大剂量组逃逸潜伏期时间最短，穿越平台次数最多及在该象限停留的时间最长。

表1 5组小鼠训练前游泳速度及逃逸潜伏期比较

表2 5组老年小鼠记忆功能检测值

2.2小鼠氧化应激的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马组织和大脑皮质中SOD、GSH-PX和NO含量均显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，醒脾解郁汤小、中、大剂量组小鼠海马组织和大脑皮质中SOD、GSH-PX和NO含量均显著升高(均P<0.05)，MDA含量显著降低(均P<0.05)。见表3，表4。

表3 5组小鼠海马组织中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

表4 5组小鼠大脑皮层中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

2.3小鼠炎症因子的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马组织和大脑皮质中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，醒脾解郁汤小、中、大剂量组小鼠海马组织和大脑皮质中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均显著降低(均P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表5和表6。

表5 5组小鼠海马组织中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.5 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in hippocampus of five groups of mice

表5 5组小鼠海马组织中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

组别IL-17AIL-2正常对照组101.68±10.39175.25±21.96模型对照组310.57±24.68①373.24±26.99①醒脾解郁汤 小剂量组263.44±11.10②316.07±12.60② 中剂量组237.89±13.86②281.31±20.96② 大剂量组191.01±9.52②③243.93±9.89②③F68.69459.381P<0.05<0.05组别IL-6 TNF-α正常对照组79.62±6.8980.03±7.22模型对照组166.65±7.48①248.97±30.76①醒脾解郁汤 小剂量组149.03±6.96②201.87±10.77② 中剂量组133.05±6.70②175.39±6.05② 大剂量组110.91±6.62②③151.64±6.04②③F81.51742.944P<0.05<0.05

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与醒脾解郁汤小剂量组比较，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

表6 5组小鼠大脑皮质中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.6 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in cerebral cortex of five groups of mice

表6 5组小鼠大脑皮质中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

组别IL-17AIL-2正常对照组99.40±7.99185.50±22.56模型对照组314.90±21.05①371.70±30.83①醒脾解郁汤 小剂量组269.11±10.92②324.21±15.56② 中剂量组230.12±8.02②286.17±11.34② 大剂量组203.30±13.94②③235.65±15.48②③F80.44559.694P<0.05<0.05组别IL-6TNF-α正常对照组87.65±10.4974.03±8.30模型对照组167.43±6.63①232.55±16.48①醒脾解郁汤 小剂量组146.82±6.25②196.55±8.39② 中剂量组130.86±6.80②182.42±12.22② 大剂量组116.56±5.01②③150.94±8.83②③F86.53156.303P<0.05<0.05

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与醒脾解郁汤小剂量组比较，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

2.4老年小鼠凋亡相关蛋白的影响 Western blotting 结果见图1。与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马组织中Bax和caspase 3蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，醒脾解郁汤小、中、大剂量组小鼠海马组织中Bax和caspase 3蛋白表达水平均显著降低(F=81.434，63.449，均P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(F=80.352，P<0.05)，且呈剂量依赖性。

3 讨论

在全身麻醉手术中，POCD是最常见的中枢神经系统并发症，患者会出现记忆损害以及学习困难等主要临床特征，POCD一般会持续>2周，严重者甚至可导致不可逆的进行性认知功能减退[8-9]。已有研究证实，POCD发病的最重要危险因素之一是全身麻醉药物的使用[1，10]。七氟醚作为临床使用最频繁的吸入性全身麻醉药物，可显著增加老年患者POCD的发病率，且七氟醚的暴露剂量与POCD患者认知功能下降的程度具有相关性[11]。Morris水迷宫实验是评估啮齿类动物学习记忆能力的重要工具，受试动物根据迷宫周围的参照物来确定平台的位置，是一种以异我为参照的认知过程[7]。本研究借助Morris水迷宫实验发现七氟醚可显著损害老年小鼠的记忆能力以及视空间学习能力，其主要表现为逃逸潜伏期延长、穿台次数减少、平台所在象限停留时间缩短，而醒脾解郁汤可有效改善七氟醚导致的小鼠学习记忆能力障碍，且呈剂量依赖性。

POCD的发生机制比较复杂，目前认为可能与麻醉手术导致的组织氧化应激、炎症因子过度释放以及细胞凋亡有关[12]。七氟醚可诱导神经元细胞变性及凋亡[13]，进一步研究发现七氟醚导致麻醉后认知障碍的机制可能与诱导细胞凋亡、炎症反应和氧化应激有关[14]。氧自由基损伤可降低大脑学习记忆能力，自由基可激发脂质过氧化的链式反应，该反应分解终产物MDA通过交联和结合形成脂褐素，导致细胞膜损伤，引起神经系统的功能障碍。而SOD、GSH-PX和NO则可以有效地清除自由基，发挥抗氧化作用，进而保护神经组织[15-16]。本研究结果显示，醒脾解郁汤可显著升高小鼠海马组织和大脑皮质中SOD、GSH-PX和NO含量，降低MDA含量，且呈剂量依赖性。这表明醒脾解郁汤正是通过发挥其抗氧化作用有效缓解七氟醚所导致的氧自由基对小鼠认知功能的损伤。细胞炎症因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的过度释放所引起的记忆长时程增强抑制被认为是导致动物认知功能损害的另一重要机制。细胞炎症因子通常可诱导谷氨酰胺神经兴奋毒性损伤、抑制海马神经元的发生、易化外周炎症因子浸润及扩大神经系统级联炎症反应等[17]。因此，抑制细胞炎症因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α等的过度释放对于预防和缓解术后认知功能障碍至关重要。王椿野等[6]研究结果显示醒脾解郁方可通过抑制抑郁模型大鼠血清以及海马中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的过度释放来改善其学习记忆能力。本研究结果显示醒脾解郁汤可显著抑制小鼠海马组织和大脑皮层中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的释放，且呈剂量依赖性。这表明醒脾解郁汤通过抑制其炎症因子的过度释放有效缓解了七氟醚所导致的小鼠认知功能的损伤。研究表明，caspases家族在缺血性脑损伤中发挥着重要的作用，caspases是细胞凋亡的启动者和执行者，caspase 3是下游最关键的凋亡调控蛋白，机体在正常情况下，caspase 3处于非活化的状态，当机体产生应激反应时，通过caspase级联反应诱导caspase切割并活化最终诱导凋亡发生。Bax与Bcl-2均属于Bcl-2家族，其分别具有促凋亡和抗凋亡作用[18-19]。本研究结果显示醒脾解郁汤可显著抑制小鼠海马组织中Bax和caspase 3蛋白表达，显著升高Bcl-2蛋白表达，且呈剂量依赖性。这表明醒脾解郁汤正是通过调控小鼠大脑细胞凋亡相关基因的表达来有效缓解七氟醚所导致的小鼠认知功能的损伤。

1.正常对照组；2.模型对照组；3.醒脾解郁汤小剂量组；4.醒脾解郁汤中剂量组；5.醒脾解郁汤大剂量组。①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05；③与醒脾解郁汤小剂量组比较，P<0.05。

综上所述，醒脾解郁汤可通过其抗氧化作用、抑制炎症因子的过度释放以及调控细胞凋亡相关蛋白的表达来有效缓解七氟醚所致的小鼠认知功能损伤，且呈剂量依赖性，但其是否还通过其他信号通路发挥作用尚需进一步更深入研究。