脂肪干细胞与富血小板血浆治疗大鼠膝骨关节炎疗效比较

楼袁美 严佳民 邱天文 杨锦荧 单乐天*

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的慢性和进行性骨代谢疾病，是影响老年人生活质量并引起疼痛反复发作甚至残疾的常见原因之一。目前尚无治愈KOA的方法，大多数研究旨在减轻痛苦和防止功能衰退［1］。富血小板血浆（PRP）是可作用于自体的浓缩血小板。PRP提供的超生理量的必需生长因子可提供再生刺激，促进低愈合潜力组织的修复［2］。脂肪干细胞（ADSCs）通过释放多种生长因子和细胞因子而起到旁分泌、抗炎和免疫调节功能，具有显著的成软骨作用［3］。研究证明，PRP和ADSCs均可起到治疗和修复骨关节炎的作用。本研究旨在比较PRP和ADSCs对KOA病变中疼痛和软骨损伤的影响，以寻求医治膝骨关节炎最佳的措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠32只，无特定病原体（SPF）级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，体重（200±20）g，生产许可证号：SCKK（沪）2007-0005，在浙江中医药大学动物实验中心进行实验。实验过程符合医学动物实验伦理委员会标准。实验时间2019年6 月至2020年1月。

1.2 试剂及仪器 IMDM液体培养基（美国sigma公司），戊巴比妥钠，PBS磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），胎牛血清，青链霉素混合液，0.25%胰蛋白酶-EDTA，Ⅳ型胶原酶（美国Worthington）碘乙酸（美国sigma公司），0.9%氯化钠注射液（中国），4%甲醛溶液，EDTA脱钙液（中国Solarbio公司），足底热辐射测痛仪（西安峰岚仪器厂），DK-S12型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），SW-CJ-1F层流超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），AXiovent200荧光倒置显微镜（BX20）（日本Olympus公司），德国Eppendof冷冻离心机（5804R）（上海艾本德中国有限公司），全自动多功能酶标仪（美国BioTek公司），YLS-3E电子压痛仪（安和盟天津科技发展有限公司），CO2细胞培养箱（3111）（美国Thermo公司）。

1.3 实验方法 （1）PRP制备及质量控制：从SD大鼠外周血中分离制备PRP。随机选取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，每只大鼠心内采血5~6 ml，将20 ml外周血收集到抗凝真空管中，以800 g离心10 min，收集血浆部分，在1000 g离心5 min，得到血小板。然后取出大部分血浆，留下3 ml血浆，使血小板再悬浮，制成1×106个/ml浓度的PRP。（2）ADSCs制备及质量控制：从SD大鼠腹股沟脂肪组织中分离制备ADSCs。随机选取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，无菌条件下从大鼠腹股沟脂肪组织中收集脂肪组织（1.5 g），置于含Hank' s的培养皿中并用磷酸盐缓冲液（PBS）反复洗涤3~5次，在5 min内将脂肪组织切成条。将Ⅳ型胶原酶溶于PBS中，使其浓度在25 ml中为0.12%，用于消化脂肪组织。消化过程在37 ℃水浴下进行，混合物需摇动1次/15 min。反应完成后，加入25 ml Hank's中和胶原酶活性。用100 µm的细胞筛过滤所得溶液，以1300 r/min离心6 min，去除上清液。将细胞接种于25 cm×25 cm培养瓶中，放置在37℃、5% CO2培养箱中培育。1 h后换液，定时察看细胞生长情况。换液1次/3 d，1周后传代。给药前收集第3代ADSCs，再次离心重悬，制成1×106个/ml浓度的ADSCs。（3）大鼠分组、造模及干预：将32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、PRP组、ADSCs组，每组各8只。向空白组大鼠双侧膝关节腔内各注射25 mg/ml生理盐水50 µl，模型组、PRP组、ADSCs组用同样方法注射25 mg/ml碘乙酸50 µl，以造KOA模型。造模1周后向ADSCs组大鼠膝关节腔内注射50 µl ADSCs，PRP组注射50 µl PRP，空白组和KOA模型组注射50 µl生理盐水，1次/周，共注射8次。（4）大鼠压痛阈值测定：大鼠压痛阈值用YLS-3E电子压痛仪测定。用固定桶固定大鼠，使其保持舒适和安静的状态，将YLS-3E电子压痛仪的扁型头向大鼠后足背施压，当大鼠因疼痛开始鸣叫或挣扎时停止施压，此时显示的压力值即为大鼠的压痛阈值，再测量另一侧。在模型复制后第1周、第4周、第8周测定压痛阈值。（5）大鼠热痛阈值测定：大鼠热痛阈值用足底热辐射测痛仪测定。热痛实验于压痛实验结束6 h后进行，将大鼠置于透明有机玻璃箱内，保持室温于23~27 ℃。等待大鼠安静后（停止梳理毛发和探索性活动），置大鼠左后足底中央于测痛仪的“十”字形标记，注意需避开足垫，然后开启仪器，当温度超过大鼠的忍受程度，出现抬腿回避，将此段时间间隔作为大鼠的热痛阈值，再测定另一侧足底。每间隔5~6 min再测定一次，各3次，并取平均值。实验时将热痛阈值测定的时间上限设定为20 s，温度上限设定为35 ℃，防止大鼠被热辐射烫伤［22］。（6）膝关节组织病理学分析：造模干预8周，最后一次测定痛阈值后，将所有大鼠断颈处死。取4组大鼠双侧膝关节并置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脱钙4周，乙醇逐级脱水，浸蜡包埋后在切片机上沿膝关节矢状面将胫骨外侧平台软骨下松质骨和股骨外侧髁软骨下松质骨沿下肢纵轴方向切片，切片厚度为5 µm，切片常规脱蜡至水，经自来水冲洗后进行HE染色、封片。光学显微镜下观察膝关节组织病理学改变，依照OARSI评分标准进行评分。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠压痛阈值测定结果 见表1。

表1 4组大鼠热痛阈值比较［s，（±s）］

表1 4组大鼠热痛阈值比较［s，（±s）］

注：与空白组比较，*P<0.01；与KOA模型组比较，#P<0.01

组别 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白组 17.47±2.52 16.64±3.38 14.20±2.54 KOA模型组 11.09±1.42* 10.79±1.43* 10.95±1.72*ADSCs组 10.93±1.74* 12.30±1.51*# 12.49±1.39*#PRP组 12.05±1.88* 12.64±1.51*# 12.40±1.23*#

2.2 4组大鼠热痛阈值测定结果 见表2。

表2 4组大鼠压痛阈值比较［g，（±s）］

表2 4组大鼠压痛阈值比较［g，（±s）］

注：与空白组比较，*P<0.01；与KOA模型组比较，#P<0.01；与ADSCs组比较，&P<0.05

组别 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白组 856.25±72.92 768.75±103.20 782.50±94.90 KOA模型组 536.25±55.31* 526.25±58.88* 514.58±65.80*ADSCs组 515.93±38.00* 536.25±49.88*# 592.18±58.40*#PRP组 525.06±47.03* 566.59±74.76*# 631.87±84.94*#&

2.3 组织病理学和OARSI评分结果 病理学结果：与空白组相比较，KOA模型组大鼠膝关节软骨表面明显存在残缺，损害处软骨细胞显著缺失，软骨面明显变薄，软骨下骨出现纤维化退行性变；PRP组或ADSCs组治疗均可改善KOA模型大鼠关节软骨损害，镜下可观察到大量的软骨细胞，软骨表面平整。其中ADSCs组软骨仍有少量软骨细胞丢失，软骨层轻度变薄，仍可见少量肥大软骨细胞，软骨下骨有少量纤维化退变；PRP组软骨基本复原，软骨面增厚（见图1）。OARSI评分结果：KOA模型组OARSI评分高于空白组、RPR组和ADSCs组，差异有统计学意义（P<0.01），PRP组OARSI评分高于ADSCs组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

图1 大鼠膝关节软骨组织病理切片（HE染色，×100）

表3 4组大鼠OARSI评分比较（±s）

表3 4组大鼠OARSI评分比较（±s）

注：与空白组、RPR组和ADSCs组比较，*P<0.01；与ADSCs组比较，#P<0.05

组别 OARSI评分空白组 0.94±0.70 KOA模型组 4.30±1.63*ADSCs组 2.66±0.90 PRP组 1.83±1.00#

3 讨论

目前KOA的临床治疗方法包括非甾体类抗炎药（NSAIDS）、皮质类固醇和透明质酸（HA）等药物治疗，手术治疗以关节置换为主［4］。但传统保守医学治疗旨在控制症状而不是改变疾病本身，药物的益处有限且具有不良的毒副作用，手术治疗甚至会导致患者的持续性疼痛或功能丧失［5］。PRP治疗具有操作简单、经济、微创等优点，可提供天然浓缩的自体生长因子（GFs），用于增强组织再生，还可被用作ADSCs的生长因子和分化因子的来源，已被证明在早期膝关节炎中具有改善疾病的作用［6］。ADSCs的免疫原性低、来源丰富、易获得，和其他种类的MSC同样具有成软骨作用，能够修复损伤的软骨，因而可用于治疗进行性发展的骨关节炎。

MOUSSA等［7］研究发现PRP能够导致膝关节炎模型软骨细胞MMP3，MMP13，ADAMTS-6，IL-6和Sox-2下降，同时提高TGF-β，Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的程度，从而调节软骨细胞生存力和保护软骨基质，抑制软骨退行性变。TAKAGI［8］等研究发现ADSCs能降低兔KOA模型软骨细胞MMP-1，MMP-13和ADAMTS-4的表达，从而抑制Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的降解，抑制关节软骨退变。但是随着时间的推移，ADSCs在关节内的营养减弱，反而引起更为严重的OA。

有研究认为脂肪干细胞治疗骨关节炎的证据有限，用SVF形式制备ADSCs治疗骨关节炎时，有>50%研究使用PRP或纤维蛋白或PRP和纤维蛋白作为辅助［9］。有研究表明，MSC在高浓度细胞因子和白细胞存在的炎症环境中，其细胞活力、成软骨和成脂肪分化潜能下降，甚至对MSC的增殖和分化能力产生不良影响，且诱导细胞凋亡，损害MSC对关节炎症的功效和治疗潜力［10-11］。且干细胞采集也比PRP所需的简单抽血更具侵袭性，这可能增加MSC治疗患者发生感染或并发症的可能性［12］。研究认为PRP通过激活α颗粒并使其蛋白如PDGF、TGF-β等脱粒与膝关节内的胶原、破骨细胞和软骨细胞上的受体结合，分泌生长因子和抗炎细胞因子，以促进软骨基质合成和组织再生，从而保护软骨细胞。由于关节内干细胞存在，上述机制将更加强烈和有效，干细胞发挥其旁分泌和营养作用，还能够分化成新的关节软骨细胞。通过这条途径延长PRP的作用时间，放大PRP的效应，从而更有效地修复软骨损伤。

本研究结果显示，在造模8周后，PRP组和ADSCs组的疼痛阈值较模型组均有提高，提示PRP和ADSCs可缓解KOA模型大鼠的膝关节炎症，提高痛阈。在第4周和第8周，PRP组的压痛阈值较ADSCs组高，表明PRP治疗效果优于ADSCs组。在大鼠膝关节软骨组织病理OARSI评分中，PRP组和ADSCs组OARSI评分均低于KOA模型组，表明PRP和ADSC均能修复KOA模型大鼠关节软骨的损害。PRP组OARSI评分低于ADSCs组，表明PRP修复效果优于ADSCs组。

综上所述，PRP和ADSCs均可提高KOA大鼠的痛阈，表明大鼠关节软骨逐渐修复，但PRP治疗KOA的效果比ADSCs的治疗效果好。证明PRP对改善KOA动物模型膝关节炎症疼痛，促进关节软骨修复有较大的优越性，且具备较高的安全性和疗效。