甲基双加氧酶对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的影响及机制

张伟杰, 张若琛, 陈义坤 , 李 岳 , 黄建安

(1. 苏州大学附属第一医院 呼吸与危重症医学科, 江苏 苏州, 215006;2. 苏州大学 呼吸疾病研究所, 江苏 苏州, 215006)

肺癌是一类恶性程度极高的癌症，在所有癌症种类中死亡率居首位。在新诊断的肺癌病例中，约85%被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)[1], 患者5年生存率仅为24%, 腺癌(LUAD)是NSCLC的主要组织学类型[2]。甲基双加氧酶(TET2)是TET蛋白家族的一员，可催化5-甲基胞嘧啶(5mC)羟基化的酶活性[3]。研究[4]证实TET2的高表达与肝癌、白血病患者的不良预后相关，同时TET2可以通过抑制CD86来抑制自身免疫[5-6]。有关TET2在NSCLC中的作用研究较少，本研究探索TET2对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及可能机制，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

人NSCLC细胞株A549、H1299、H460、SPC-A1和人正常支气管上皮细胞BEAS-2B均从中国上海中科院细胞库/干细胞库购买; TET2引物(Genewiz公司); Trizol、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒 (TaKaRa公司); Lip 2 000转染试剂 (Thermo公司); 胎牛血清(Gibco公司); RPMI-1640 培养基(Corning公司); 抗体: TET2(Millipore公司)、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Cyclin D1和β-actin抗体及二抗(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: A549、H1299、H460、SPC-A1和BEAS-2B均使用RPMI-1640培养基培养，培养基于培养细胞前均加入10%胎牛血清配制成完全培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.2.2 瞬时转染: 细胞于前1 d铺板至六孔板中，第2天观察细胞密度为50%～60%即可进行转染，转染步骤严格按照说明书进行。

1.2.3 细胞内TET2 mRNA的检测: Tizol裂解细胞后提取总 RNA，按照试剂盒说明书进行反转录及RT-PCR检测。TET2 上游引物序列为5′-GATAGAACCAACCATGTTGAGGG-3′, 下游引物序列为5′-TGGAGCTTTGTAGCCAGAGGT-3′。

1.2.4 CCK8和克隆形成实验: 将转染完成的细胞消化计数后，按每孔3 000个细胞的密度铺至96孔板中，并进行CCK8实验。第2天每孔中加入10 μL CCK8试剂，于培养箱中培养2 h后，用酶标仪测定吸光度差值，绘制增殖曲线。将3 000个细胞加入60 mm培养皿中，约50个集落形成后即中止培养，用甲醇固定细胞后加入结晶紫染色，计数克隆数。

1.2.5 Transwell实验: 预先向侵袭实验的小室中加入基质胶，培养箱中孵育2 h。将转染完成的细胞消化计数，迁移实验上室中加入40 000个细胞，侵袭实验加入60 000个，24 h后甲醇固定结晶紫染色，棉签擦去未穿透的细胞，于镜下200倍视野下拍照计数。

1.2.6 Western blot实验: 用RIPA提取细胞总蛋白，每60 μL样品加入16 μL 5×loading buffer和4 μL 二硫苏糖醇(DTT)。电泳完成后，湿转2 h, 封闭1 h后一抗4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育2 h, 用增强化学发光法(ECL)显影对条带进行显色。

1.2.7 流式细胞术: 将转染完成的细胞加入70%乙醇固定过夜，用PI染色液对细胞进行染色，上机进行细胞计数。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 TET2在NSCLC细胞株中高表达且与患者预后相关

在线数据库显示TET2的高表达与肺腺癌患者的不良预后相关，见图1A。NSCLC细胞株中TET2的mRNA以及蛋白表达量均高于人正常肺上皮细胞，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001), 见图1B。

A: TET2表达与总生存率关系; B: TET2在非小细胞株中的蛋白和mRNA表达水平。n: 肺腺癌患者。**P<0.01, ***P<0.001。图1 TET2在NSCLC细胞株中高表达且与患者预后相关

2.2 敲低TET2可以抑制NSCLC细胞株的增殖能力

瞬时转染si-TET2后，A549和H1299细胞中TET2的mRNA和蛋白表达均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 见图2A; CCK8(图2B)以及克隆形成(图2C)结果提示敲低TET2, NSCLC细胞株增殖能力被显著抑制(P<0.01或P<0.001)。

A: 瞬时转染si-TET2干扰序列后TET2的mRNA和蛋白表达水平,与NC比较, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; B: CCK8法检测敲低TET2对细胞增殖能力的影响,与si-TET2-NC比较, **P<0.01, ***P<0.001; C: 克隆形成实验检测敲低TET2后对细胞集落形成能力的影响,与NC比较, ***P<0.001。图2 敲弱TET2可以抑制NSCLC细胞株的增殖能力

2.3 敲弱TET2可以抑制NSCLC细胞株的迁移和侵袭能力

干扰TET2后, A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力显著减弱(P<0.001), 见图3。

A、B: Transwell实验检测干扰 TET2后A549和H1299侵袭和迁移能力的变化(放大倍数200倍); C: Transwell实验干扰 TET2后A549和H1299细胞数柱状图。与NC比较, ***P<0.001。图3 敲弱TET2可以抑制NSCLC细胞株的迁移和侵袭能力

2.4 敲弱TET2阻滞细胞周期于G0/G1期

敲弱TET2可以将细胞阻滞于G0/G1期，并降低S期细胞比例，见图4。

A、B: 流式细胞术检测干扰TET2后A549和H1299细胞周期变化; C: A549、H1299细胞周期的细胞数柱状图。与NC比较, **P<0.01, ***P<0.001。NS: 无显著性。图4 敲弱TET2阻滞细胞周期于G0/G1期

2.5 TET2对EMT标志物和细胞周期蛋白的影响

在 A549、H1299细胞中，敲低TET2后, N-cadherin、Vimentin和Cyclin D1蛋白的表达显著下调, E-cadherin的表达显著上调，见图5。

A、B: Western blot法检测干扰TET2后EMT相关蛋白和Cyclin D1蛋白变化; C: A549、H1299蛋白印迹条带灰度扫描后绘制成柱状图。与NC比较, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。β-actin: 内参基因。图5 TET2对EMT标志物和细胞周期蛋白的影响

3 讨 论

TET2作为去甲基化蛋白家族中的一员，已有研究[7]报道同一蛋白家族的TET1在NSCLC中的高表达与患者的不良预后相关。TET2在多种疾病的发生、发展中均扮演了重要的角色，已有研究[4]证实TET2的高表达与肝癌、白血病患者的不良预后相关，同时TET2可以通过抑制CD86来抑制自身免疫[5-6], 但TET2在肺癌中的功能尚未阐明。本研究通过数据库发现TET2的高表达与NSCLC患者的不良预后相关，并证实TET2可以通过调控细胞周期和EMT进程，促进NSCLC的增殖、迁移和侵袭能力。

TET2作为去甲基化蛋白可以参与甲基化过程，甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，在胞嘧啶的C5位上面加上一个甲基，形成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程，其过程受甲基化酶和去甲基化酶的严格调控[8]。甲基化主要发生在NSCLC的早期阶段，研究[9]表明，BALF的SHOX2/RASSF1A甲基化检测对Ⅰ期的肺癌患者有极高的检出率，为85.7%, 远高于血清CEA和细胞学的10.7%和46.4%。另一项研究[10]通过检测患者外周血ctDNA中的SHOX2、PTGER4和IDH1的甲基化频率，证实这3个基因的联合诊断效能显著高于单一标志物对肺癌患者的诊断效能。故寻找TET2的甲基化修饰蛋白，发掘新的NSCLC的甲基化诊断标志物，并通过非侵入性手段检测外周血基因的甲基化频率，可在提高诊断效能的同时，加强NSCLC的早筛早诊，为其诊断提供新的策略。EMT是指上皮细胞丢失原本具有的细胞间的紧密连接，向间质细胞的形态和特性转变的过程[11-12]。研究[13-15]证实, EMT过程可以促进肺癌、黑色素瘤和乳腺癌的转移。本研究发现，干扰TET2后可以逆转EMT进程。EMT在靶向治疗后的耐药研究[16- 17]中同样被证实具有重要作用，逆转EMT进程对细胞恢复对靶向药物的敏感性发挥重大作用，但TET2在耐药过程中发挥的作用本研究并未进一步探索。

综上所述, TET2在NSCLC细胞株中高表达，并且可以通过影响细胞周期EMT进程，促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，针对此靶点可以为NSCLC的治疗和诊断提供新的策略。