鱿鱼II型胶原免疫调控巨噬细胞的体外研究

戴美璐 隋佰延 刘 昕 陆 华 孙 皎

（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔材料科，上海生物材料研究测试中心， 上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心， 上海市口腔医学重点实验室，上海 200011）

修复退变的关节软骨是治疗颞下颌关节退行性骨关节炎的关键，现有的非手术疗法（如关节腔内注射润滑剂或药物抗炎等）只能暂时缓解临床症状，却无法改善软骨的损伤和阻止疾病的发展[1，2]。造成这一现状的主要原因之一是病变的关节软骨局部存在着以巨噬细胞为代表的固有免疫细胞的活化反应，它改变了关节软骨局部的微稳态，严重限制了软骨修复[3]。因此，如果能调控局部微环境以主动诱导成软骨作用，可能是当前非手术治疗骨关节炎的关键。

II型胶原是软骨的重要胶原成分，在软骨细胞的生长发育和成熟过程中必不可少。有报道显示II型胶原或II型胶原基复合材料（支架、水凝胶等）在负载成软骨因子的条件下具有促进软骨细胞的基质分泌功能，并可以在体内促进非炎症性关节软骨缺损（手术造模）的即刻修复[4,5]。但这些研究应用的II型胶原除了都来源于猪、牛、鸡等陆生动物，存在着价格昂贵、一定的免疫原性风险及受宗教因素限制等不足以外[6]，关键上述研究都只是建立在非炎症状态下的研究结果；而针对退行性骨关节炎这样的复杂环境下究竟能否发挥软骨修复效应也仍是一个巨大的挑战。课题组前期研究已发现海洋生物鱿鱼II型胶原（SCII）具有与陆生动物II型胶原相似的氨基酸成分、没有免疫原性，而且能在体外炎症模型中明显的抑制巨噬细胞的致炎效应[7]。因此，SCII可能是一种潜在的、能够在退行性骨关节炎病理环境下实现病损软骨修复的新型生物材料。

我们知道，作为机体固有免疫系统的重要成分之一，巨噬细胞可以因局部的各种刺激因素使其从静息期（M0）转变成炎症型（M1）或抗炎型（M2）。对于退行性骨关节炎而言，如何设法诱导M0向M2转化可能是改变局部微稳态和促进损伤组织修复的新途径，这方面目前未见报道。鉴于已有文献证明，通过生物材料的刺激与诱导可使M2型巨噬细胞分泌多种生长因子，它们在促进伤口愈合、间充质干细胞的体外成骨分化中发挥免疫调控的作用[8,9]；而且我们之前已经发现SCII能显著抑制炎症环境下M1型巨噬细胞的致炎功能，接下来我们有兴趣去进一步探讨SCII是否对巨噬细胞的M2表型激活具有特定的免疫调控作用，使其分泌出利于软骨细胞活性和功能的细胞因子，从而达到促进软骨修复的免疫调控目的。该研究思路对退行性骨关节炎治疗具有重要价值。

综上，本研究以修复颞下颌关节退行性骨关节炎的退变软骨为宗旨，引入自行研制的无免疫原性的SCII，研究其对M0巨噬细胞向M2型转化的免疫调控效应，探究M2巨噬细胞表达与局部成软骨微环境形成密切相关的成软骨基因的能力，并揭示其相关机制，为该胶原用于缓解退行性骨关节炎的应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 SCII的提取

SCII由上海市水产研究所提供。分离鱿鱼软骨，将其洗净、冻干并粉碎成软骨粉，依次用4%（w / w）NaOH溶液和0.5M EDTA处理24h。将上述所得处理液中加入胃蛋白酶，处理48～96 h后盐析、透析并冻干，得到纯化的SCII[7]。

1.2 细胞培养及条件培养

小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞是从American Type Culture Collection（ATCC） 购买，应用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100 mM/ml链霉素的高糖Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 （HDMEM， Hyclone， 美国） 培养，培养环境为37℃，5% CO2。

在研究SCII对巨噬细胞极化表型的免疫调控效应的试验中，将M0型巨噬细胞（即静息状态的未分化的RAW264.7）接种至SCII包被培养板[11]，培养48 h后通过PCR试验检测巨噬细胞表型。

1.3 PCR试验

采 用PrimeScript RT reagent Kit （TaKaRa， 日本）提取上述各组巨噬细胞中的总RNA，并逆转录为cDNA。用SYBR PremixEXTaq （TaKaRa， 日本）检测巨噬细胞中的M1标志基因（iNOS， IL6， TNF-α， IL1β）、M2标志基因（Arg1， Fizz1， MR， Ym1， IL10）和促成软骨基因（TGF-β1， TGF-β2， TGF-β3， IGF1， IGF2）的表达水平。以GAPDH作为参照，引物见表1。

表1 细胞引物设计

1.4 Western blot试验

应用Western Blot试验探索SCII调控M0型巨噬细胞极化的机制。

将M0型巨噬细胞按照以下分组培养：①对照组：接种至空白培养板，用普通培养基培养；②SCII组：接种至SCII包被培养板，用普通培养基培养；③抑制剂组：接种至SCII包被培养板，用添加了STAT6抑制剂leflunomide （100mM， Sigma-Aldrich， USA）[12]的培养基培养。各组培养48 h后，收集细胞并提取总蛋白[13]，上样到SDS 聚丙烯酰胺凝胶。4℃下用一抗孵育过夜，分别是p-STAT6 （1∶1 000， CST， USA）， STAT6 （1∶1 000， CST， USA）和 β-actin （1∶1 000， Abcam， UK），再经室温下二抗孵育1 h后，用ECL化学发光剂（Millipore， USA） 显影。

1.5 p-STAT6表达及定位试验

用免疫荧光试验检测巨噬细胞中p-STAT6的分布位置。巨噬细胞用western blot试验部分相同的处理方式分组和培养。细胞经固定、封闭后用p-STAT6 （1∶400）一抗孵育，再经荧光二抗孵育，在共聚焦显微镜（Leica Microsystems， 德国）下观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 SCII对巨噬细胞M 2型极化的影响

PCR检测M0型巨噬细胞在SCII作用下的极化表型标志基因表达，结果如图1A和1B显示，M1型巨噬细胞（致炎）标志基因（IL-1β、TNF-α、iNOS和lL-6）的表达水平没有显著变化，而M2型巨噬细胞标志物——甘露糖受体（特征性膜受体，MR）、精氨酸酶1（Arg-1）、炎症相关缺氧诱导有丝分裂因子1（Frizzl）以及几丁质酵样蛋白（Yml）的表达显著提高。进一步检测发现，经SCII诱导后的M2型巨噬细胞表达成软骨基因TGF-β（1-3亚型）和IGF（1-2亚型）水平亦显著提高（图1C）。

2.2 SCII诱导巨噬细胞M 2型极化的机制

Western blot结果显示，SCII具有促进巨噬细胞STAT6磷酸化的作用（图2A），并促进磷酸化的STAT6（p-STAT6）进而入细胞核内（图2B）。

图1 SCII免疫调控活化M2型巨噬细胞

图2 SCII激活M2型巨噬细胞的潜在机制

3 讨论

颞下颌关节退行性骨关节炎发生时，对于受损软骨的修复方案除了需要控制炎症以外，关键还是要能改变局部促软骨修复的微环境。基于SCII已被证明具有明显的抗M1型巨噬细胞炎症的功能[10]，本研究从软骨修复的角度进一步发现：SCII具有免疫调控激活巨噬细胞M2表型、促进巨噬细胞表达促成软骨基因等多种生物功能，这也是其可能用于修复损伤关节软骨的途径和机制。

M0巨噬细胞的转型对于退行性骨关节炎的病理发展十分重要[3，14]，而如何能使病损组织附近的静息型巨噬细胞（M0）激活为M2型巨噬细胞是修复病变软骨的关键，因为M2型巨噬细胞可以影响局部微环境，并参与某些组织的修复[15]。基于这一思路，在退行性骨关节炎发生时，如果能通过免疫调控的特殊功能诱导激活M2型巨噬细胞，则有利于使原本处于炎症状态的微环境转变为利于软骨修复的微环境，这将是一种全新的治疗理念。本研究的结果提示，SCII能特异性激活M2型的巨噬细胞、抑制M1型巨噬细胞活化，具有明显的免疫调控M2型巨噬细胞极化的作用（图1A，B）。据报道：M2型的巨噬细胞可以通过分泌一些生长因子影响微环境、参与组织的修复，如骨和皮肤[8,16]；那么，SCII激活的M2型巨噬细胞能否实现对软骨修复微环境的调控呢? 这关键还是要看其对与软骨修复直接相关的成软骨基因是否发挥了作用。因此，本研究继而检测并证实：在SCII免疫调控激活的M2型巨噬细胞中，与软骨细胞的活性和功能密切相关的成软骨基因TGF-β和IGF的表达水平有明显上调（图1C），这为后续研究巨噬细胞对软骨细胞的免疫诱导效应奠定了基础。

尽管上述结果表明，SCII对局部成软骨微环境的建立有积极的作用，但SCII是如何影响巨噬细胞表型的机制仍不清楚。以往研究显示，STAT6的磷酸化激活和入核是M0型巨噬细胞向M2型极化转变的关键[17]，而本研究的实验结果证实，在SCII的作用下巨噬细胞中STAT6的磷酸化水平和入核水平均显著增加（图2A，B），这提示我们SCII免疫激活M2型巨噬细胞表型转变的机制与STAT6有关。SCII刺激巨噬细胞中STAT6的磷酸化激活，同时促使其进入细胞核内，从而促进了M2标志基因的转录。

在本研究中，已经证实SCII成功诱导M2激活且促进促成软骨基因的表达，课题组将进一步设计SCII-巨噬细胞-软骨细胞条件培养实验，以研究在SCII免疫调控的M2巨噬细胞条件培养基中软骨细胞表达软骨基因、分泌软骨基质的能力。

4 结论

本研究基于颞下颌关节退行性骨关节炎的关节局部微环境的病理性变化，率先发现：SCII能够免疫调控M2型巨噬细胞的活化，并能促进其表达成软骨基因（TGF-β和IGF）影响局部微环境，而TGF-β和IGF上促进软骨细胞分泌软骨基质的重要因子。从这一生物学现象可以推测，SCII是一种适用于治疗颞下颌关节骨关节炎的新型可注射型软骨修复材料，具有潜在的临床应用价值。