利用分子标记辅助选择创制抗赤霉病小麦新品系

刘建军，李豪圣，陈雪燕，贾海燕，翟胜男，郭军，程敦公，刘成，曹新有，刘爱峰，宋健民，刘佳，楚秀生，马正强

（1.山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东 济南 250100；3.南京农业大学农学院，江苏 南京 210095）

小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）引起的一种严重的穗部病害。赤霉病一直是影响我国长江中下游麦区、东北春麦区以及华南麦区小麦产量与品质最严重的病害。近年来，受气候变暖、矮秆品种的推广、复种指数的提高和秸秆还田等因素的影响，小麦赤霉病流行区域不断扩大，由长江中下游地区迅速向小麦主产区的黄淮冬麦区乃至北部冬麦区扩展，并且由偶发性病害变为常发性病害和主要病害［1］。2012年我国小麦赤霉病大流行，全国小麦受害面积达1 000万公顷［2］。赤霉病的发生不仅影响小麦产量和品质，而且产生的DON等毒素给食品安全造成很大隐患［3］。培育和推广抗病品种是防治赤霉病最经济、有效、安全和可靠的途径。

小麦抗赤霉病基因／QTL主要有两类，分别是抗扩展（TypeⅡ）的Fhb1［4］、Fhb2［5］、Fhb3［6］和Fhb7［7］等以 及抗 侵入 （TypeⅠ）的Fhb4［8］和Fhb5［9］等，上述基因已被正式命名且已建立与其紧密连锁的分子标记或功能标记［3-10］。其中，位于3B染色体上的Fhb1基因是目前为止公认的效应最大、抗性最稳定的抗赤霉病基因［3，4］，一般认为该基因位点具有良好的抗扩展效应，也有研究表明该位点同时具有抗侵染效应和抗DON毒素积累效应［11］；来源于6BS染色体的Fhb2是仅次于Fhb1的抗扩展主效基因［11］。

通过品种间杂交，长江中下游麦区已创制和培育出一批在育种和生产上可以利用的抗源和中等抗病的品种，而目前黄淮冬麦区尤其是黄淮北片的小麦品种绝大部分高感赤霉病，缺少赤霉病抗性品种［12，13］。随着分子生物学的发展，抗病基因的定位和分子标记技术日臻完善和成熟，分子标记辅助育种技术开始被广泛应用。美国、加拿大、澳大利亚和日本等发达国家已经利用Fhb1分子标记辅助选育出了一批小麦新品种，其赤霉病抗性显著提高［10］。2012年以来，提高小麦新品种赤霉病抗性成为黄淮冬麦区主要育种目标之一。抗源筛选和抗病材料创制是抗赤霉病品种选育和推广的基础，长江中下游抗赤霉病较好的品种和种质材料属春性、耐寒性差，难以在黄淮北片抗赤霉病品种选育中直接应用，冬性和半冬性的小麦赤霉病抗源种质材料匮乏。

本研究以南京农业大学创制的抗赤霉病中间材料为抗源、黄淮麦区北片优良品种（系）为农艺亲本，利用分子标记辅助选择和常规育种技术，创制出目标性状比较突出、综合性状较为优良的半冬性抗赤霉病育种材料，为培育适宜种植黄淮地区、既高产又抗赤霉病的小麦品种奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 供试亲本材料

抗赤霉病基因供体材料NMAS020是南京农业大学利用望水白主效QTL近等基因系与PH691杂交创制的抗赤霉病中间材料，含有Fhb1（位于3B染色体）、Fhb2（6B）、Fhb4（4B）和Fhb5（5A）共4个抗赤霉病基因；农艺亲本1济麦22是山东省农业科学院作物研究所选育的高产稳产广适小麦品种；农艺亲本2石H083-366是石家庄市农业科学院育成的综合性状优良且高抗白粉病的小麦新品系。

1.2 选育方法

1.2.1 抗赤霉病育种群体构建及杂种后代选育方法 2014年4月以NMAS020为母本、以济麦22为父本进行杂交，获得F1。2015年4月以杂种F1为母本，以含抗白粉病基因Pm21的石H083-366为父本复交，复交目的主要是提高杂种后代白粉病抗性；2016—2019年复交后代采用系谱法主要针对耐寒性、株高、株型、穗部性状、粒色及白粉病抗性等进行选育，单株和株系利用分子标记跟踪检测抗赤霉病基因；2020年对55个性状基本稳定、综合性状优良的品系采用单花滴注法接种鉴定赤霉病抗性，济麦22为感病对照。

1.2.2 分子标记检测 与抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5紧密连锁的标记特异引物序列及其扩增程序参照相关文献［4，5，8，9］，引物由青岛擎科天成生物技术有限公司合成。利用常规PCR筛选出每条染色体上扩增效率高、多态性好的引物，采用不同颜色的荧光染料对其末端进行标记，应用ABI3730XL全自动DNA分析仪进行毛细管电泳和荧光信号收集，利用GeneMapper v4.0进行数据分析。

1.2.3 田间调查、抗性鉴定和评价 55个品系及对照济麦22于2019—2020年度种植于山东省农业科学院作物研究所15条田，顺序排列，不设重复；6行区，小区长4 m，宽1.5 m，机械条播，基本苗15万株（666.7m2）。幼苗习性、株型、粒型和株高等农艺性状调查参考农作物品种区域试验技术规范 小麦（NY／T 1301—2007）。

赤霉病抗性鉴定所用菌种为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）15-A DON型，由江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所惠赠，采用单花滴注法人工接种鉴定。用微量移液器取10μL分生孢子悬浮液（1.0×105～1.5×105个／mL），注入麦穗中部刚开花的小穗内；每个品种接种5穗，接种麦穗套保鲜袋保湿3 d，接种后21 d调查每个接种穗的发病小穗和总小穗数，计算平均感病小穗数和平均感病小穗率（%），作为赤霉病抗性评价指标［9］。

1.3 数据统计与分析

利用SAS软件Windows version 9.0系统（SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA）、采用邓肯氏多重比较法（Duncan’s Multiple Range Test，P＜0.05）进行不同基因／QTL及其组合间感病小穗数和感病小穗率差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同基因／QTL及其组合出现的频率

育种实践表明，苏麦3号和望水白等赤霉病抗源材料及其衍生系虽然具有良好的赤霉病抗性，但农艺性状、其它病害抗性和丰产性等较差，由于基因连锁关系，在进行综合性状选择时往往会导致抗赤霉病目标基因的丢失［10］。本研究的抗赤霉病复交育种群体，经过连续4代田间优良单株和株系农艺性状选择最终保留了55个品系，经抗赤霉病分子标记检测，55个品系中有35个品系含有1～3个抗病基因／QTL位点，占63.6%；不含任何位点的有20个，占36.4%（表1）。尽管杂种各世代都进行了分子标记检测，并且在早代曾出现过15种基因／QTL组合类型（包括4个基因／QTL组合类型，Fhb1＋Fhb2＋Fhb4＋Fhb5），但可能由于田间综合农艺性状的选择，结果只出现了9种基因／QTL组合类型。

含有不同抗病基因／QTL及不同抗病基因／QTL组合的品系赤霉病抗性不同（表1）。在仅含有一个抗病基因／QTL位点的4类品系中，含有Fhb1和Fhb4的品系平均感病小穗数和平均感病小穗率明显低于含Fhb2和Fhb5类型的品系及对照济麦22，赤霉病抗性较好。在含有2个抗病基因／QTL组合中，含有Fhb2＋Fhb5的品系平均感病小穗数和平均感病小穗率最低，赤霉病抗性最好；含Fhb1＋Fhb2的品系次之，两者明显低于Fhb1＋Fhb4和Fhb2＋Fhb4的品系；含Fhb2＋Fhb4品系的平均感病小穗数和平均感病小穗率最高。含有单一抗病基因／QTL与含有两个同类型抗病基因／QTL的表现不一致，可能是由于基因／QTL间互作等原因所致。

表1 不同基因／QTL及其组合的品系数量及感病小穗情况

2.2 不同基因／QTL及其组合赤霉病抗性效应

从总体上看，含有不同数量的抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗数和平均感病小穗率均有显著差异。含有3个抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗数和平均感病小穗率显著低于含有2个抗赤霉病基因／QTL，含有2个抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗数和平均感病小穗率显著低于含有1个抗赤霉病基因／QTL，含有1个抗赤霉病基因／QTL的显著低于不含任何抗赤霉病基因／QTL的品系（表2）。根据赤霉病严重度分级标准和评价标准（农业行业标准）［14］，含有一个抗病主效基因／QTL可达到中感水平，含2个基因可达到中抗及以上抗性水平，含有3个抗病基因／QTL可达到高抗水平，不含任何主效基因／QTL的品种（系）（包括对照济麦22）表现高感赤霉病。

表2 含不同数量抗病基因／QTL品系赤霉病抗性

2.3 优良品系济麦8681和济麦8775综合表现

抗赤霉病基因／QTL分子标记检测结果显示，55个品系中，济麦8681和济麦8775均含有Fhb1和Fhb2两个抗赤霉病基因／QTL。田间单花滴注法接种鉴定结果表明，济麦8681和济麦8775的平均感病小穗数和平均感病小穗率均较低，表现抗或高抗赤霉病（表3，图1A、B），可作为抗赤霉病育种的优良亲本材料。

济麦8681综合农艺性状表现较好（图1C），该品系幼苗半匍匐，叶片较窄，苗色较浅，耐寒性好（2＋级）；株型较为紧凑，株高78 cm，抽穗期较对照济麦22早5 d左右，成熟期早3 d，为中早熟品种；穗椭圆形，长芒，白壳，白粒，籽粒椭圆形，千粒重45 g。含抗白粉病基因Pm21，田间表现高抗白粉病。小区产量530.1 kg（每666.7m2，下同），较对照济麦22增产3.29%。

济麦8775综合农艺性状表现较好（图1D），该品系幼苗半直立，叶片较窄，苗色较深，耐寒性好（2＋级）；株型较为松散，株高81 cm，抽穗期较对照济麦22早4 d，成熟期早2 d，为中熟品种；穗长方形，长芒，白壳，白粒，籽粒椭圆型，千粒重42 g。田间表现中抗白粉病。小区产量518.0 kg，较对照济麦22增产0.85%。

表3 济麦8681和济麦8775赤霉病抗性检测结果

图1 济麦8681和济麦8775的赤霉病抗性表现及田间生长情况

3 讨论与结论

国内外小麦抗赤霉病育种的抗源主要是中国的苏麦3号和望水白、日本的新中长、巴西的01234232及偃麦草等外源种质等［15］。苏麦3号和望水白是田间赤霉病抗性表现最佳、遗传背景不同的两个品种，均含有Fhb1和Fhb2主效基因／QTL［11］。美国北达科他州立大学利用苏麦3号育成了携带Fhb1抗赤霉病硬红春小麦品种Alsen，年推广面积为95万公顷，占该州小麦种植面积的1／3左右。20世纪70年代，西北农林科技大学利用苏麦3号进行抗赤霉病育种，创制出一批抗病中间材料，为黄淮麦区选育具有赤霉抗性的品种奠定了基础［3］。廖玉才等［16］的研究表明控制望水白抗赤霉病基因有5～6对。贾高峰等［17］研究表明，望水白赤霉病抗性受2～3对主基因控制，可解释70%以上的抗性。Lin等［18］从望水白／南大2419重组自交系群体中定位到了4B和5A的2个抗侵染QTL，分别可以解释17.5%和27.0%的表型变异。此后，Xue等［8，9］将位于4BL染色体上的位点定位在1.7 cM的范围并命名为Fhb4，将位于5AS位点精细定位到0.3 cM的范围内并命名为Fhb5。本研究发现含有3个抗赤霉病基因／QTL的品系赤霉病抗性＞含有2个抗赤霉病基因／QTL的品系＞含1个抗赤霉病基因／QTL的品系＞不含抗赤霉病基因／QTL的品系；不同抗赤霉病基因／QTL及不同抗病基因／QTL组合对小麦赤霉病抗性表现不同，含Fhb2＋Fhb5的品系平均感病小穗数和平均感病小穗率表现最低、赤霉病抗性最好，含Fhb1＋Fhb2的品系次之，两者明显低于Fhb1＋Fhb4和Fhb2＋Fhb4的品系，含Fhb2＋Fhb4品系的平均感病小穗数和平均感病小穗率最高。本研究还发现，含有1个或几个抗赤霉病基因／QTL的品系也不一定都表现良好的赤霉病抗性，所以，分子标记跟踪检测杂交后代比较有效，但只是辅助手段，最终需要田间赤霉病抗性鉴定进行抉择。

高产或丰产与抗赤霉病相结合是小麦育种的世界性难题，程顺和院士等［1］提出用中感到中抗的丰产亲本材料之间进行配组取代赤霉病抗性好但丰产性差的亲本间的组配，在后代鉴定筛选时，针对综合丰产性的同时进行抗赤霉病选择，以解决丰产性与赤霉病抗性之间的矛盾。苏麦3号和望水白等赤霉病抗源材料及其衍生材料主要来自长江中下游等春麦区，由于生态类型不同、光温反应差异大及植株高、穗育性差和白粉等病害重等不利因素，根据小麦赤霉病抗性是由多基因控制的数量遗传特点，黄淮冬麦区尤其是黄淮北片难以直接利用这些抗源材料选育既抗病又高产广适的品种，因此，宜采取循序渐进、逐步改良的策略，首先创制各具特色的抗病材料，进而再利用创制的含有不同抗病基因或不同抗性来源的材料选育高产抗病品种；在杂交组配方式上宜采取复交、回交、阶梯聚合杂交等，聚合多个抗赤霉病基因和多个优良性状；在杂种后代群体数量上宜适当放大群体，增加抗赤霉病和综合农艺性状优良个体选择概率；在杂种后代选择上要借助分子标记辅助选择，提高育种效率；同时，更要重视对优良株系或品系进行表型抗性鉴定，最终实现抗赤霉病和高产的有机结合。本研究综合利用分子标记辅助选择和常规育种策略，创制出综合性状优良且高产抗赤霉病小麦新品系济麦8681和济麦8775，为抗赤霉病种质在冬小麦育种中奠定了物质基础。