小麦黄花叶病抗性鉴定和全基因组关联分析

郭营，孙俊生，屈春艳，2，郭宝晋，赵岩，李斯深

（1.山东农业大学／作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 271018；2.枣庄学院，山东 枣庄 277160）

小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的一种土传病害，以土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）为传毒介体。近年来，该病害在我国冬麦区发生日趋严重，已逐渐成为生产上的一种重要病害，主要发生在黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区的部分地区和西南冬麦区的四川盆地等［1-3］。由于该病毒存在于禾谷多黏菌休眠孢子体内，而禾谷多黏菌休眠孢子堆壁厚，具有很强的抗逆性，因此很难用化学方法防治。鉴定筛选抗源、选育小麦黄花叶病抗性品种是控制该病害的根本途径。国内学者已经进行了一些小麦抗黄花叶病种质的筛选工作，如孙炳剑等［4］对河南62个主推小麦品种进行了小麦黄花叶病的抗性评价，筛选出扬辐9311、宁麦9号等10个抗病品种；魏玮等［5］对国内外527个小麦品种（系）进行小麦黄花叶病抗性鉴定，筛选出包括丰抗1号、石家庄72、郑麦9023等10个抗病品种；刘丽娟等［6］对黄淮地区的145个小麦品种进行小麦黄花叶病抗性评价，筛选出濮优938、新麦208等70个免疫品种，豫麦47、邯6172等50个抗病品种。

小麦黄花叶病抗性是受多基因调控的数量性状，遗传基础复杂，受基因型和环境效应影响显著。连锁分析和全基因组关联分析已成为数量性状基因定位和挖掘的重要途径。前人利用F2、重组自交系（recombinant inbred lines，RIL）等遗传分析群体，在2A、2D、3B、4D、5A和7B等染色体上检测到多个小麦黄花叶病抗性的数量性状位点（QTL）［7-12］。相较于连锁分析，全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）以自然群体为材料，来源广泛（如野生种、地方品种、现代品种和高代品系），基因多态性较高，无需构建双亲群体，具有发掘效率高、分辨率高且成本较低的优点，目前利用自然群体进行小麦黄花叶病抗性的研究较少。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，具有在基因组中数量多、分布广、遗传稳定性高、可自动化分析等优点。近年来，国内外科学家已开发出多款小麦SNP芯片，如9K、90K、55K、660K和820K芯片［13-18］，为GWAS分析提供了高基因组覆盖度的基因型分型数据，并在小麦产量、品质、抗病性等相关性状基因的挖掘中得到了广泛应用［19-23］。

本研究对我国黄淮麦区134份小麦品种（系）进行小麦黄花叶病抗性鉴定，以期筛选出抗病种质，为育种家提供优异抗源。结合90K SNP芯片基因型分型数据和病情指数，通过全基因组关联分析，以期获得显著关联的分子标记位点，为小麦黄花叶病抗性遗传改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为我国黄淮麦区134个小麦品种（系）组成的自然品种群体（表1）。供试材料分别于2014—2015（E1）、2015—2016（E2）、2016—2017（E3）年度种植于山东省泰安市岱岳区小麦黄花叶病连续多年均匀发病的自然病圃。田间种植采用随机区组设计，每年10月中上旬播种，每材料种植3行，行长1.5 m，行距25 cm，每行点播40粒种子，重复2次，常规田间管理。

1.2 小麦黄花叶病抗性鉴定

分别于2015年（3月14日）、2016年（3月4日、3月21日）、2017年（3月11日、3月21日）进行田间抗病性鉴定，每个材料调查全部植株。单株抗性鉴定分级参照刘伟华等［24］的指标：0级，无症状；1级，轻度花叶，叶片不产生梭状条纹症状，植株不矮化；2级，花叶明显，梭条或黄花叶症状占叶面积的1／2左右，植株轻度矮化；3级，严重花叶，梭条或黄花叶症状占叶面积的3／4左右，植株明显矮化。根据单株病级鉴定结果，计算病情指数（disease index，DI），计算公式为：病情指数＝Σ（各级病株数×各级代表值）／（调查总株数×最高级代表值）×100。每个供试材料在同一时间鉴定的2个重复DI抗性结果取平均值，同一年的两次抗性结果以DI较大值作为该品种（系）该年度抗性结果。品种抗病性分级标准：抗病（R），DI＜5%；中抗（MR），5%≤DI＜15%；中感（MS），15%≤DI＜25%；感病（S），DI≥25%［24］。

1.3 基因型分型

利用小麦90K SNP芯片［13］对品种群体进行基因型分型。在得到的多态性SNP中，去除最小等位基因频率（MAF）小于5%、缺失率大于15%的SNP位点，7 357个SNP有遗传位置信息，分布在21条染色体上，用于下一步的关联分析［25］。

1.4 全基因组关联分析

利用TASSEL 5.0软件，采用混合线性模型（MLM），以主成分分析（PCA）和亲缘关系（Kinship）作为协变量，结合7 357个SNP标记基因型数据，对134份小麦品种（系）的DI值进行关联分析，设置阈值P＜0.001，曼哈顿图使用CMplot程序包完成（https://github.com／YinLiLin／RCMplot）。

1.5 数据分析

3年DI结果的最佳线性无偏预测（best linear unbiased prediction，BLUP）采用R版本3.6.1（https://www.r-project.org／）软件进行限制最大似然（REML）分析。利用SPSS 17.0软件对小麦黄花叶病发病指数进行表型数据分析。性状广义遗传力计算公式为为遗传方差和环境方差。

2 结果与分析

2.1 小麦黄花叶病的抗性鉴定

供试的134个小麦品种（系）对小麦黄花叶病的抗性存在明显差异，并且同一品种（系）在不同年份发病情况也有一定差异（表1）。其中，抗病品种（系）27个，占供试材料的20.15%，包括烟农0428、烟99603、山农18、山农17、烟农836、济麦20、烟农999、济麦22、良星99、烟农21、藁优9618、山农23、泰农18、济麦21、954（7）-8、济南17、西农889、鲁麦23、潍麦8号、LS3283、山农25、汶农5号、山农21、LS4942、郯麦98、临旱822、昌乐5号；中抗品种（系）21个，占供试材料的15.67%，分别为陕627、山农45、莱州95021、汶农6号、山农29、M8008、新麦26、泰山21、鲁麦21、泰山24、烟农19、山融3号、石新828、鑫麦289、山农664、烟农15、鲁麦14、石麦15、石家庄8号、烟5072、山农8355；中感、感病品种（系）分别为21、65个，占供试材料的15.67%、48.51%。

通过对134份小麦品种（系）在不同环境下的病情指数进行分析，结果（表2）表明：变异系数范围为87.18%～140.82%，广义遗传力为70.65%。方差分析结果表明，品种（系）间、不同年份间的差异是变异的主要来源，DI的基因型和环境效应值均在P≤0.001水平差异显著。

表1 134份小麦品种（系）的黄花叶病抗性表现

表1（续）

表2 134个品种（系）在不同环境下的病情指数统计分析

2.2 全基因组关联分析

结果显示，56个SNP与小麦黄花叶病病情指数显著相关，分别位于2A（1个SNP）、2B（4个SNP）、2D（43个SNP）、3A（4个SNP）、4B（1个SNP）、7B（3个SNP）染色体上，可解释8.8%～29.6%的表型变异（图1，表3）。其中，在2D染色体上检测到在3个环境和BLUP中均显著关联的SNP标记有40个，占所有关联标记的71.4%。根据SNP遗传位置［25］，2D染色体的40个SNP位于76.57～86.28 cM区间（表3）。

图1 全基因组关联分析的曼哈顿图

表3 与小麦黄花叶病病情指数显著关联的SNP标记

表3（续）

3 讨论与结论

小麦黄花叶病广泛发生于黄淮麦区、长江中下游麦区等冬小麦主要种植区域，由于感病品种的种植及农业机械的跨区作业，该病害的发病面积有逐渐扩大的趋势。选育并推广种植抗病品种是防治小麦黄花叶病大面积发生的最有效途径。本研究连续3年对134个小麦品种（系）进行小麦黄花叶病的抗性鉴定，结果发现不同品种（系）对黄花叶病的抗性差异较大。本研究筛选出抗病品种（系）27个，包括目前生产上大面积种植和近年来审定的品种如山农18、山农17、烟农836、烟农999、济麦22、良星99、烟农21、山农23、泰农18、济南17、山农25、郯麦98等，建议在小麦黄花叶病主要发病麦区（黄淮麦区北片）推广种植，也可作为抗病育种的亲本材料加以利用。另外，筛选出21个中抗品种，可以通过与高抗品种进行轮作或者间作，达到延长抗病品种使用年限的目的。

本研究利用7 357个SNP标记与3年小麦黄花叶病病情指数及BLUP值进行关联分析，共检测到56个与小麦黄花叶病病情指数显著关联的SNPs，分别位于2A、2B、2D、3A、4B、7B染色体上；在2D染色体上检测到在3个环境和BLUP中均显著关联的SNP标记40个，位于76.57～86.28 cM区间，表明上述标记基因的表达受环境影响较小，是稳定关联的标记位点。前人的研究也在2D染色体检测到抗病位点：如Takeuchi等［26］以高抗品种‘Madsen’和高感品种‘Hokushin’为亲本构建F2群体，将‘Madsen’的抗病基因YmMD定位于2DL上，位于SSR标记wmc041和gwm349之间；Nishio等［8］用高抗品种‘Ibis’和高感品种‘Munstertaler’为亲本构建DH群体，通过遗传分析发现高抗品种‘Ibis’的抗病基因Ymlb位于2DL上，与SSR标记cfd16、wmc41、cfd168和wmc181紧密连锁；Kobayashi等［12］用高抗品种‘Yumechikara’和高感品种‘Kitahonami’为亲本构建DH群体，通过遗传分析将抗病基因Q.Ymym定位于2D上，与SSR标记cfd233和gwm349紧密连锁。由此可见，2D染色体含有较多抗黄花叶病基因，值得进一步深入研究利用。