前茬作物对植烟土壤细菌多样性及群落结构的影响

邹 静，黄 莺，李熙全，昝建朋，张 权，明 堂，蒙 骏

（1. 贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省烟草公司安顺市公司，贵州 安顺 561000）

健康土壤是农产品数量和质量的重要保障。近年来，在集约化的农业生产中，土壤过度使用和不合理的管理制约了土壤生态系统服务功能。目前，较高的复种指数、单一的作物种植、药肥过量施用等现状，导致土壤微生物多样性下降，微生物区系失衡，土传病害增加，严重影响作物品质和产量[1]。土壤微生物的数量、活性、生理或行为的变化是反映土壤健康状况的重要指标[2]。学者们常用土壤微生物量、生物多样性、群落结构和功能基因表达等来反映土壤健康状况[3-5]，为探讨田间养分的转化、土传病害预防提供了可行方法。前人的研究表明，调整种植模式会改善土壤微生物多样性、群落结构，减轻烤烟连作带来的危害[6]；种植不同的作物会影响养分循环及供应，微生物群落结构也会因此改变[7]；王飞等[8]在研究翻压不同绿肥对植烟土壤细菌类群影响时发现，翻压绿肥的微生物多样性显著高于不翻压绿肥的，翻压不同的绿肥对作物产生的影响也不相同；祖伟军等[9]从土壤微生物丰度与酶活性2个方面探讨了翻压绿肥对土壤的影响，得出翻压绿肥可以提高土壤微生物的丰度，增加有关氮循环相关的酶活性等结论；刘勇军等[10]发现添加了有机物料的土壤中部分酶活性提升、烟叶品质也得到改善。

当前贵州的耕地复种指数仍然较高，并且在短时间内这一情况不会改变。与此同时，农村产业结构的调整，促使烤烟前茬作物种类和耕作模式变化，烤烟种植制度正发生着变化。从传统的“玉米或水稻—油菜—烤烟”种植模式转变为“蔬菜—蔬菜或休闲—烤烟”模式，在此影响下，新的土壤微生物区系与结构必将重新构建。探明不同前茬作物对植烟土壤微生物群落多样性的影响，筛选出有利于农田生态环境改善和烤烟产、质量提高的前茬种植模式，可为合理调整和优化配置植烟土壤的不同土地种植模式提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试地点和供试土壤

试验于2019年在贵州省安顺市西秀区杨武乡进行。供试土壤为黄壤，其基本理化为：pH值5.95，有机质含量51.33 g/kg，碱解氮265.32 mg/kg，有效磷25.70 mg/kg，速效钾168.55 mg/kg，容重0.91 g/cm3。

1.2 试验设计

试验选择贵州冬季种植较为广泛的作物参试，以冬闲为对照，共设置4个前茬处理，分别为：紫云英（KY1，绿肥翻压还田）、黑麦草（KY2）、白菜（KY3）、冬闲（KY4，CK），每个处理3次重复。小区面积133.4 m2。

2019年10月15日整地并播种紫云英、黑麦草，同时进行白菜育苗，11月28日移栽白菜。紫云英、黑麦草、撂荒处理均不施肥，白菜处理在移栽7 d后施用尿素6.06 kg/667m2。作物栽培至2020年3月，3月17日采收白菜、黑麦草后整地，紫云英（绿肥）直接翻压后整地。

1.3 土壤样品采集

烤烟种植起垄施肥前，于2020年4月17日在每个小区用5点取样法采集土壤样品，采样深度0～45 cm。土壤样品采集以后立即放入预先灭菌的羊皮纸袋密封，放入冰盒暂存，带回实验室后放入超低温冰箱（-80℃）保存，用于微生物多样性研究。

1.4 土壤微生物DNA提取及测序

采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit从土壤样品中提取细菌总基因组DNA，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，便于PCR扩增。细菌扩增区间为16S rDNA的V3～V4区，引物为515F（5'-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGTW TCTAAT-3'）。PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用胶回收试剂盒（QIAGEN公司）回收目的条带。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，通过NovaSeq6000上机测序。

1.5 数据分析

对Illumina NovaSeq测序得到的数据进行质量控制，对原始数据进行拼接、过滤，利用Uparse软件对所有样本的全部有效序列进行聚类，按照97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时选取OTUs的代表性序列，生成OTU表格。用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析获得分类学信息，并按界门纲目科属种统计各样本的群落组成。细菌Alpha多样性由Chao1指数、香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）、ACE指数表征。细菌群落结构间的差异采用除趋势对应分析表征。

2 结果与分析

2.1 各处理土壤样本细菌测序数据分析

经过高通量测序，共获得307 226条高质量的有效序列，其中KY3处理的高质量有效序列最多为86 324条，KY2的最少，为72 656条；平均序列长度除KY4为414 nt外，其他处理均为415 nt；覆盖率的范围为98.6%～99.0%，说明样品中绝大部分细菌的序列能够被测出，可以反映细菌群落的真实情况（表1）。从图1可以看出，随着样本容量和序列数的增加，OTU的增加速率逐渐减缓，然后会趋于平坦，即使检测样本量增多，也只会产生少量新的OTU，最终OTU总量趋于定值。这表明，取样的数量及深度在一定程度上可以覆盖整个群落。

表1 不同前茬作物土壤细菌测序数据统计

图1 不同前茬作物土壤细菌稀释曲线

由图2可知，KY1、KY2、KY3、KY4处理的土壤样品中OTU数量分别为3 479、3 183、3 321和3 356个，4个处理共有的OUT数量为2 144个，分别占各处理OUT总数的61.63%、67.36%、64.56%、63.89%。KY1、KY2、KY3、KY4处理特有的OUT数量分别为222、113、173、260个，依次占各处理OTU总数的6.38%、3.55%、5.21%、7.74%。其中KY4处理独有OTU数量最多，预示着该处理样本中含有较多的特有微生物种类。

图2 不同前茬作物土壤细菌venn图

2.2 不同前茬作物对植烟土壤细菌多样性的影响

Alpha多样性可分析样品内菌种类别的丰富度和菌种数目的均匀度，Alpha多样性越高，细菌种类越丰富，群落越稳定[11]。ACE指数和Chao1指数属于丰富度指数，用于估计群落中含OTU数目的指数，群落物种的丰富度越高则其值越高[12]；辛普森、香农指数反映物种优势度[13]。由表2中可知，KY1、KY2、KY3处理的辛普森指数差异不显著，但是均显著高于KY4，说明冬季土壤休闲后，细菌多样性降低，分布不均匀；香农指数、Chao1指数、ACE指数也均以KY4处理的最低，但处理间无明显差异；说明KY4土壤细菌群落结构及丰富度劣于其他处理。KY1的4项指数均最高，说明种植紫云英，且从绿肥的形式翻压还田更有利于土壤微生物群落结构的稳定。

2.3 不同前茬作物处理下植烟土壤细菌组成的差异

相似的生态环境下，不同处理土壤细菌在门水平上具有较高的相似性，4个处理间相对丰度排名前10的优势细菌所占比例均达到95%以上。尽管各优势菌门所占比例有差异，但前10个优势菌门在4个处理间是相同的（图3），包括Proteobacteria（变形菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）、Latescibacteria和unidentified Bacteria（未知细菌门），Others（其他）表示10个门之外的其他所有门的相对丰度之和；优势菌门中以变形菌门和酸杆菌门为主，占总序列的54.81%～63.31%；酸杆菌门在KY4处理中占比仅为17.08%，显著低于其余3个处理，但厚壁菌门在KY4处理中占比高于其他3个处理，但差异未达到显著水平。

表2 不同前茬作物土壤细菌Alpha多样性指标

图3 不同前茬作物土壤细菌在门水平上的相对丰度

不同前茬作物导致土壤细菌在门水平上存在数量与种类的差异，4个处理中KY1的独有菌门最多，有6种，分别是Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；KY3有3个独有菌门，分别为Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria；KY2与KY4无独有菌门。

3 结论与讨论

微生物群落结构受种植作物的影响[14]。现有不少研究已经证明，不同的土地利用方式、翻压不同作物会影响土壤微生物所处的环境，从而导致其组成与丰度的差异，产生共有的或特异的群落结构[15-19]。

试验结果表明，各处理土壤细菌物种数由高到低排列依次为KY1＞KY3＞KY4＞KY2，处理间差异不显著；KY1、KY2、KY3处理的辛普森指数显著高于KY4（冬闲，CK），说明对照处理的物种优势度低；而各处理的香农指数、Chao1指数和ACE指数差异不显著。

试验结果还显示，不同处理间土壤细菌均以变形菌门、酸杆菌门为主，这2种菌门都是土壤中较重要的菌门，其在土壤生物化学循环中起着重要作用[20]。变形菌门与根瘤菌的共生固氮密切相关[21]，研究中它是第一优势菌门，可能是因为变形菌门是嗜养菌门，翻压作物增加了土壤中有机质的含量，所以相对丰度较高。变形菌门可以提高土壤质量，促进植株生长[22]，而KY4的变形菌门相对丰度高于其他处理，可见人为干扰较少的土壤韧性高，与林耀奔等[23]研究不同土地利用方式对微生物群落结构的影响中的结论一致。酸杆菌门排名次之，因为酸杆菌门中含有丰富的编码纤维素酶和淀粉水解酶的基因序列，所以可以分解动植物残体，改善农田土壤碳循环[24]，取样时土壤里植株残体正是丰富的时候，酸杆菌门丰度自然较高。

研究还发现，KY1处理有6种特异菌门，分别为Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；其 中，Nitrospirae与Nitrospinae是亚硝酸盐氧化细菌，主要功能是能将亚硝氮转为硝氮，推动氮循环[25-26]；Margulisbacteria主要参与氮还原、亚硝酸盐还原、硫酸盐还原，推动硫、氮、碳循环，说明种植紫云英促进了土壤氮循环，不仅通过固氮作用提高了土壤氮含量，还促使土壤氮的分解转化，但是紫云英翻压后的分解，可能会因消耗大量土壤氧气而引起还原过程加剧；Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria和Hydrogenedentes等菌门目前为止还未鉴定出具体功能。KY3有3种独有菌门，分别是Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria，其中Euryarchaeota含有产甲烷古菌和甲烷氧化古菌，是地球碳代谢循环的重要驱动力[27]，Parcubacteria和Gracilibacteria还未见在土壤功能方面的报道。

研究仅从微生物多样性方面对烤烟前茬作物进行了探讨，之后可以结合土壤理化性质进行综合评价，选择最优的烤烟前茬作物。另外，研究中发现的Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Parcubacteria和Gracilibacteria这5种菌门的功能未见具体报道，之后可对其在土壤中的功能进行鉴定。