基于网络药理学探讨桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制

李小芬 方镕泽 冯华

【摘 要】 目的：運用网络药理学的方法预测桑寄生“补肝肾 强筋骨”的作用靶点及相关信号通路 为桑寄生传统功效的阐释提供参考。方法：利用中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库、网络药理学在线数据库（TCMID）和《中华本草》搜索桑寄生化学成分 并筛选其活性化学成分。运用TCMSP数据库和Swiss TargetPrediction数据库预测活性化学成分的作用靶点。运用GeneCards数据库和OMIM数据库预测“补肝肾 强筋骨”相关的疾病靶点。运用STRING数据库构建“药物-疾病”交集靶点PPI网络 并采用cytoscape 3.6.1软件进行可视化分析 筛选核心靶点;同时采用cytoscape 3.6.1 软件构建“活性成分-核心靶点-疾病”网络。利用Cytoscape 3.6.1软件中的ClueGO插件进行基因本体 （GO）生物学过程和基于京都基因与基因组百科全书 （KEGG）通路富集分析。结果：筛选得到8个活性化合物 358个靶点蛋白 其中RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、表皮生长因子受体、转录因子AP-1和雌激素受体等靶点可能是桑寄生“补肝肾、强筋骨”的关键靶点。桑寄生“补肝肾、强筋骨”主要涉及细胞增殖、代谢过程、生物合成过程、炎症反应等生物过程 通过调控甲状腺激素、破骨细胞分化、HIF-1、TNF、NF-κB、雌激素、长寿调节途径和JAK-STAT等信号通路来发挥“补肝肾、强筋骨”作用。结论：本研究初步揭示了桑寄生传统功效“补肝肾、强筋骨”的分子作用机制 体现了桑寄生“多成分-多靶点-多途径”的作用特点 为进一步的药效物质基础和作用机制实验研究提供了参考依据。

【关键词】 桑寄生;活性成分;补肝肾、强筋骨;网络药理学;分子机制

Abstract：Objective To predict the target and related signaling pathways of Taxillus chinensis （DC.） Danser of tonifying liver and kidney， strengthening muscles and bones by using network pharmacology method， and provide reference for the interpretation of the traditional efficacy of Taxillus chinensis （DC.） Danser. Methods The chemical constituents of Taxillus chinensis（DC.）Danser were searched by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） database， Traditional Chinese Medicine Integrated Database （TCMID） and Chinese herbal medicine， and their active chemical components were screened. The TCMSP database and the Swiss TargetPrediction database were used to predict the target of active chemical constituents. The GeneCards database and the OMIM database were used to predict the disease targets associated with tonifying liver and kidney， strengthening muscles and bones. The STRING database was used to construct the PPI network of the drug-disease intersection， and the cytoscape 3.6.1 software was used for visual analysis to screen the core targets. The cytoscape 3.6.1 software was used to construct the “active ingredient-core target-disease” network. Gene Ontology （GO） biological process and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were performed using the ClueGO plug-in in Cytoscape 3.6.1 software. Results Eight active compounds and 358 target proteins were screened. The target of RAC-α serine/threonine protein kinase， epidermal growth factor receptor， transcription factor AP-1 and estrogen receptor may be Taxillus chinensis （DC.） Danser. The key target of liver and kidney and strong bones. The Taxillus chinensis （DC.） Danser “tonifying liver and kidney， strengthening muscles and bones” mainly involves biological processes such as cell proliferation， metabolic processes， biosynthesis processes， and inflammatory reactions， by regulating thyroid hormone， osteoclast differentiation， HIF-1， TNF， NF-κB， and estrogen. The long-lived regulatory pathway and JAK-STAT and other signaling pathways play a role in “tonifying liver and kidney， strengthening muscles and bones”. Conclusion This study preliminarily reveals the molecular mechanism of the traditional efficacy of Taxillus chinensis （DC.） Danser of tonifying liver and kidney， strengthening muscles and bones， and embodies the characteristics of “multi-component-multi-target-multi-pathway” of Taxillus chinensis （DC.） Danser， which is the basis of further pharmacodynamics and The mechanism of action mechanism provides a reference basis.

Keywords：Taxillus Chinensis （DC.） Danser; Active Ingredient;Tonifying Liver and Kidney;Strengthening Muscles and Bones; Network Pharmacology;Molecular Mechanism

桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser的干燥带叶茎枝 具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元等功效 用于风湿痹痛 腰膝酸软、筋骨无力、崩漏经多、妊娠漏血、胎动不安、头晕目眩等症[1]。桑寄生始载于《神农本草经》 被列为上品 是临床常用的祛风湿药 而其补肝肾、强筋骨、安胎等作用在临床上应用也非常广泛 已经被历代的医家在实践中证实[2-4]。现代研究发现 古典理论认为的“肝藏血”“肾藏精”以及“肝主筋”“肾主骨”与现代医学研究能够完全契合 为临床运用“补肝肾、强筋骨”法则治疗筋骨疾病提供了可靠依据[5]。肾气旺盛 肾精充足 骨骼则健壮 骨髓生化有源 四肢百骸功能正常;肝血充盛 筋骨得到充沛的濡养 才能强健有力。因此 临床上补肝肾、强筋骨是骨质病变的主要治法之一[6]。桑寄生主要含黄酮类、生物碱、萜类、多糖、蛋白质等化学成分 其中黄酮类成分为主要活性成分[7-9]。研究[9]发现 桑寄生水煎液可抑制骨吸收 提高骨质量 改善骨代谢的负平衡状态 从而达到治疗骨质疏松的作用。体外研究[10]表明 黄酮类物质可通过抑制破骨细胞分化 促进骨形成 起到抗骨质疏松的作用。目前 有关桑寄生“补肝肾、强筋骨”的药效研究已有报道[9，11] 但从细胞及分子水平系统全面的揭示桑寄生以何种途径发挥“补肝肾、强筋骨”作用的分子机制鲜见报道 亟待进一步加强。

传统中医药（理、法、方、药）由于缺乏分子生物学的表征 无法发挥其独特的优势 难以与现代科学有机的融合[12]。近年来 随着网络药理学的兴起 它主要是通过构建和整合“成分-靶标-通路-疾病”多层次网络 分析特定信号节点之间的相互作用关系 从系统、整体角度探索药物与机体相互作用的一门新学科[13-14]。网络药理学被认为是一种提高新药临床试验的成功率 节省药物研发费用的新方法 尤其有助于阐明多组分和多靶标之间潜在的复杂关系 而其整体性、系统性的特点更是与中药“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点不谋而合 为中医药复杂系统的研究提供了新的思路[15-16]。因此 本文采用网络药理学的方法 通过数据挖掘、筛选、构建桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络 探讨桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制 以期为桑寄生传统功效作用机制的阐释提供参考依据。技术路线如图1所示。

1 方法

1.1 化学成分的收集 通过查阅《中华本草》、 中国知网（CNKI， http：//kns.cnki.net/kns/brief/default_result.aspx）、PubMed数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、中医药综合数据库TCMID （http：//www.megabionet.org/tcmid/）和中药系统药理学分析平台（TCMSP， http：//lsp.nwu. edu.cn/tcmsp.php） 搜索桑寄生所有化学成分。

1.2 活性成分的筛选 口服生物利用度（oral bioavailability OB） 是评估药物能否开发的关键参数 也是评价中药临床疗效的有效指标。类药性（ drug likeness DL） 目前被广泛用于评价先导化合物药物是否有可能成药的重要依据。在TCMSP 数据库中认为 OB>30%的分子具有较好的口服生物利用度 DL>0.18的分子具有较好的类药性[17]。将桑寄生所有化学成分 以ADME（吸收、分布、代谢、排泄）参数（OB≥30%和 DL≥0.18）或生物活性（文獻已有报道）为标准 筛选桑寄生的活性化学成分。然后通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索活性化学成分的结构式。

1.3 药物靶点与疾病靶点的建立 通过TCMSP数据库和Swiss TargetPrediction（http：//www.swissta rgetprediction.ch/）数据库 检索桑寄生活性化合物对应的靶点 建立活性成分靶点数据集。通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM http：//www.omim.org/）和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”为关键词检索“补肝肾、强筋骨”相关的靶点 建立疾病靶点数据集。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）查询转化成UniProt ID格式。

1.4 核心靶点的筛选及网络的构建 将药物靶点与疾病靶点进行取交集 存在交集中的靶点即为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的预测靶点。将其导入String数据库（https：//string-db.org/）中构建“药物-疾病”交集靶点PPI网络 并采用cytoscape 3.6.1 软件对PPI网络进行可视化分析 以网络中每个节点的拓扑参数“节点连接度”（Degree）、“节点介度”（Betweenness centrality）、“节点紧密度”（Closeness centrality）的中位数为卡值 选取同时满足大于3个卡值的节点 作为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的核心靶点;同时采用cytoscape 3.6.1 软件构建“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络。

1.5 生物过程分析 将核心靶点输入Cytoscape3.6.1软件的ClueGO插件中进行基因本体（GO）生物學过程和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 以 P≤0. 01作为筛选标准 筛选出具有极显著性差异的生物过程和信号通路。

1.6 构建桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的通路图 运用KEGG （https：//www.genome.jp/kegg/）数据库中的KEGG Mapper功能 将核心靶点映射在相关信号通路上 揭示桑寄生多靶点、多途径的治疗作用。

2 结果

2.1 桑寄生活性成分的筛选 从《中华本草》、中国知网、PubMed数据库、TCMSP数据库和TCMID数据库中得到目前桑寄生已报道的58个化学成分 根据ADME参数（OB≥30%和 DL≥0.18）或生物活性（文献已有报道）为标准 共筛选得到8个桑寄生活性化合物 并下载其结构式 结果见表1。

2.2 桑寄生活性成分靶点预测 将 TCMSP、Swiss TargetPrediction数据库检索得到的所有靶点 删除重复靶点 最终得到8个活性成分对应的靶点 共计358 结果见表1。在OMIM和GeneCards数据库以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”为关键词检索整合得到1535个“补肝肾、强筋骨”相关的疾病靶点。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库查询转化成UniProt ID格式。

2.3 桑寄生核心靶点的筛选 将药物靶点与疾病靶点进行取交集 得到88个交集靶点 并绘制韦恩图 结果如图2所示。将交集靶点输入String数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络 并采用cytoscape 3.6.1 软件对PPI网络进行可视化分析 得到所有节点3个拓扑参数的中位数值分别为15（Degree）、0.0042（Betweenness centrality）、0.5119（Closeness centrality） 选取同时满足大于3个拓扑参数中位数值的节点 作为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的核心靶点 结果见表2;同时采用cytoscape 3.6.1 软件构建“核心靶点”PPI网络 结果如图3所示。

2.4 桑寄生“补肝肾、强筋骨”核心靶点网络构建 通过cytoscape 3.6.1 软件分别构建“中药-活性成分”网络、“活性成分-靶点”网络、“疾病-靶点”网络 将以上网络合并成为一个网络 最终构建“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络 结果如图4所示。

2.5 GO生物过程富集分析 将33个核心靶点输入Cytoscape 3.6.1软件的ClueGO插件中进行GO生物过程富集分析 保留P≤0.01的结果 进行可视化分析 结果如图5所示。结果共富集得到 68个生物过程 根据Term P-value越小 Term可靠性越高的原则 列举了排名前20的生物过程 结果如图6所示。结果表明桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用主要可能是通过调控胶质细胞分化 活性氧生物合成过程 对生长激素的反应 胰岛素样生长因子受体信号通路 肽基酪氨酸自磷酸等多个生物过程而起到治疗功效 体现了中药多途径的治疗作用。

2.7 桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的通路注释图 将33个核心靶点输入KEGG数据库的KEGG Mapper功能中 标注出核心靶点在每条相关信号通路中所占的个数。结果显示有8个靶点蛋白参与雌激素信号通路的相关调控 揭示桑寄生多靶点、多途径的治疗作用 结果如图8所示。

3 讨论

桑寄生强筋骨的作用被历代医家所认可 现代医学研究认为肝脏是多种营养物质代谢的中枢 也是人体维生素、激素等代谢的场所 这就是中医理论所说的“肝藏血”。肾脏影响维生素D的形成及控制钙、磷等元素的代谢 这就是中医理论所说“肾主骨生髓”的作用。中医理论认为“肝主筋”“肾主骨”“肝肾同源”与现代医学研究能够完全契合 而其强筋骨作用与补肝肾作用密切相连 是补肝肾作用的体现和应用[5，18]。郑磊等[6]从“肝主筋”“肾主骨”“肝肾同源”3个方面探讨了“补肝肾、强筋骨”的作用机制 结果表明其主要与肝脏能量代谢、核酸代谢 肾脏影响维生素D的形成、激素、钙、磷代谢等生理过程相关 为“补肝肾、强筋骨”的现代研究提供了可靠依据。

本研究预测出桑寄生主要有效成分为槲皮苷、槲皮素、没食子酸、维生素C、萹蓄甘、β-谷甾醇等 主要为黄酮类成分。研究[19]表明 萹蓄苷、槲皮苷为桑寄生补肝肾、强筋骨功效的代表性成分。桑寄生中槲皮素可诱导肿瘤细胞凋亡 抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和新生血管生成[20] 槲皮苷具有抑制乙酰胆碱酶和苏氨酸激酶等作用[21]。研究[22]发现桑寄生叶子中富含丰富的维生素C 维生素C具有强烈的生理活性 参与人体多种代谢 是人体必需的维生素之一 具有解毒和改善肝功能、保持肌肤润滑、清除自由基、保护心脏及血管、抗肿瘤等作用。网络药理学分析结果表明 AKT1、SRC、EGFR、TNF、JUN、PTGS2、ESR1可能为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的潜在靶点。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶  该蛋白参与多种生物学过程 包括代谢 增殖 细胞存活 生长和血管生成等 均是通过一系列下游底物的丝氨酸/苏氨酸磷酸化来介导的。AKT激活依赖于PI3K途径 并被认为是该途径中的关键节点。乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠关节软骨的形态结构 抑制关节软骨中与炎症相关信号转导通路的激活 下调p38 MAPK、JNK、Ras、ERK、iNOS 蛋白含量表达 发挥保护关节软骨 延缓膝骨关节炎病理进程作用[23]。雌激素受体（estrogen receptor ESR1）可延长破骨细胞的存活时间、减少其凋亡 抑制破骨细胞的活性和分化 最终达到抑制破骨细胞的骨吸收 防治骨质疏松的作用[24]。

GO生物过程富集分析 表明桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用涉及细胞增殖、代谢过程、生物合成过程、炎症反应等生物过程 其中胶质細胞分化 活性氧生物合成过程 对生长激素的反应 胰岛素样生长因子受体信号通路 肽基酪氨酸自磷酸可能为桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的主要进程。KEGG通路富集分析 表明桑寄生主要是通过调控NF-κB信号通路 长寿调节途径 破骨细胞分化 C型凝集素受体信号通路 JAK-STAT信号通路 雌激素信号通路 催乳素信号通路 甲状腺激素信号通路 PI3K /AKT信号通路 MAPK 信号通路发挥“补肝肾、强筋骨”作用的。在PI3K /AKT 信号通路中 当AKT 及其靶基因激活时 可促进成骨细胞的分化 小鼠敲除 AKT1 和 AKT2 基因 会出现明显的骨量减少症状 提示成骨细胞可能通过 PI3K /AKT信号通路促进骨形成[25]。MAPK 信号通路是调控成骨细胞生长和分化的重要途径 研究[26]表明其主要包括ESR1通路 p38通路和JNK通路。ESR1信号通路能上调成骨细胞中Osterix mRNA的表达 抑制骨吸收 升高骨密度。

综上所述 本研究采用网络药理学的方法 构建“中药-有效成分-核心靶点-疾病”“靶点-通路”网络 发现桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制涉及多个生物过程、多条通路 体现了中药多成分-多靶点-多途径的作用特点。提示桑寄生“补肝肾、强筋骨” 的作用机制可能是以上靶点和信号通路共同作用的结果。但是具体的结果仍需要进一步的实验加以证明。

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（收稿日期：2020-08-18 编辑：陶希睿）