微生物菌肥对罗汉果根结线虫和土壤酶活性的影响

冯世鑫 蒋妮 陈乾平 蒋水元 唐辉

(1广西壮族自治区药用植物园广西南宁530023;2广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所广西桂林541006)

罗汉果［Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey］为葫芦科罗汉果属植物，也是药食两用甜味植物，其果实为常用大宗药材。主产于中国广西，广东、福建有引种。罗汉果含罗汉果甜苷、黄酮、维生素等活性成分，具有清热润肺、利咽开音、润肠通便等作用［1］。罗汉果甜苷是一种低热量高甜度天然甜味剂，其甜度堪称世界之最［2］；除作中药制剂以外，还可将其提取加工成为一种新型甜味剂，广泛应用于保健品、饮料之中。罗汉果产品畅销全国和欧美国家，成为当地经济收入主要来源。

罗汉果的生产过程受根结线虫病的严重影响，常造成生长不良、萎蔫、甚至死亡。有研究报道，在不使用杀线农药的情况下，根结线虫发病率高达86.67%，其病情指数达61.78%［3］，植株受为害后，枯萎病、根腐病等土传性病害发生严重，造成复合侵染［4］。根结线虫病感染所造成的减产轻者为15%～30%，重者达60%～70%［5］，严重制约着罗汉果产业的发展。罗汉果根结线虫病病原主要为南方根结线虫（MeloidogyneincognitaChitwood）［6］，是一种定居型内寄生线虫，分布于10～30 cm土层，一年发生4～6代，世代重叠，常以卵和2龄前幼虫随病株残体遗留在土壤中越冬，以2龄幼虫侵入根内；以病土、灌溉水、病苗、农具，以及施用未腐熟农家肥方式传播。生产上，常使用灭线磷（ethoprophos）、米乐尔（isazofos）、克线磷（nemacur）、氯化苦等高毒、高残留农药来防治，且药剂用量逐年加大，造成产品农残超标和环境污染，已威胁到人类身体健康。许多相关学者致力于动植物和微生物及其代谢物的杀线剂研发。微生物菌肥主要是通过微生物的生命活动使作物获得特定的肥料效应或生防效应［7］。目前以拟淡紫青霉、哈茨木霉菌剂对根结线虫病防治效果较好，但应用于大田时则防效较低［8-9］。改良型微生物菌肥是本研究组自主研制的产品，是以桐麸、油茶麸和蓖麻籽为主体，殖入长柄平菇菌、枯草芽孢杆菌，并增加低聚壳聚糖、有机硒等发酵精制而成，为植物源与微生物源相结合的功能性微生物菌肥，初步发现该菌肥具有促进植物生长和抑制线虫活性的作用。为更好地开发和利用这一微生物菌肥，在室内毒力试验的基础上，探讨其在大田中对罗汉果根结线虫病的防治效果及对土壤酶活性的影响，为促进罗汉果产业发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况

试验于2019年4月在广西壮族自治区桂林市永福县永福镇渔洞村进行。试验地为连作3年种植罗汉果的地块，该地块为丘陵地，沙质壤土，含有机质11.67 g/kg，全氮0.29 g/kg，碱解氮87.65 mg/kg，速效磷39.47 mg/kg，速效钾104.26 mg/kg，pH 6.3。

1.1.2 材料

试验所用的改良型微生物菌肥（以下简称为微生物菌肥）由广西药用植物园自主研制；淡紫拟青霉颗粒剂由北京德瑞福科技开发有限公司生产，有效菌数为0.2×108cfu/g；复合肥由欧洲化学安特卫普公司生产，中国中化集团有限公司提供的狮马牌复合肥，含氮15%、磷15%、钾15%。种苗为广西药用植物园培育的普丰青皮罗汉果扦插苗。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

设置微生物菌肥施肥水平如下：T1，1 kg/株；T2，2 kg/株；T3，3 kg/株；T4，4 kg/株。以淡紫拟青霉颗粒剂47 g/株＋复合肥0.5 kg/株的处理作为对照（为体现“改良的微生物肥”是在现阶段水平下的创新，选用淡紫拟青霉颗粒剂作对照）。罗汉果种植的株行距为2.0 m×2.5 m，以土堆的形式种植。将各处理的肥料总量一次性施入，与土堆中的土拌匀后，用黑色地膜覆盖，四周压紧。种植时，在土堆的顶部将地膜开口，开浅坑，将袋装种苗去除营养袋后植入，轻压，淋水。小区面积为45 m2，3次重复。

1.2.2 性状测定

1.2.2.1 土壤虫口减退率

在处理前和处理后的40、80、120 d分别取根际土壤100 mL，用改良贝尔曼漏斗法分离线虫；在解剖镜下，调查根结线虫2龄幼虫的数量，计算各生长时期2龄幼虫虫口退减率（简称虫口减退率，下同）。计算公式如下：

虫口退减率＝（处理前2龄幼虫数－处理后2龄幼虫数）/处理前线虫数量×100%

1.2.2.2 土壤酶活性测定

在处理后的40、80、120 d分别取根际土壤，测定脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性。参照朱新玉等方法［10］，采用靛酚比色法测定脲酶活性；用磷酸苯二钠法测定磷酸酶的活性；用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

1.2.2.3 防效调查

在11月果实采收后，将根部挖出，用清水洗净，查看根部出现根结的数量，计算根结发病株率、病情指数和相对防效。根结分级标准［11］分为0～6级，具体如下：

0级，无根结；

1级，10%以下的根出现根结；

2级，10%～20%的根出现根结；

3级，21%～40%的根出现根结；

4级，4l%～60%的根出现根结；

5级，61%～80%的根出现根结；

6级，8l%～100%的根出现根结。

计算公式为：

根结发病株率＝根结发病株数/调查株数×100%

病情指数＝Σ（病级数×该级发病株数）/（调查总株×最高级数）×100

相对防效＝（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.2.2.4 果实产量和有机硒含量的测定

在果柄变黄时，分批采收，统计结果数量，参照中华人民共和国农业行业标准罗汉果（NY/T694）方法分级，计算中大果比率。后熟7 d后，烘烤至干；随机选取30个中果，测定单果重和硒含量，硒含量参照GB 5009.93—2017《食品安全国家标准》中的氢化物原子荧光光谱法测定。

1.2.3 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据处理，用Duncan’s法分析检验显著性。

2 结果与分析

2.1 微生物菌肥对罗汉果根结线虫病的抑制作用

试验结果表明，施用微生物菌肥可显著降低土壤中根结线虫2龄幼虫的数量，虫口减退率有随着施肥水平的增加而增大的趋势，其中T4处理在施用80 d时虫口减退率最高（表1），达到67.8%，显著高于对照；其次为T3，在施用40和80 d时，T3与T4的虫口减退率差异不显著；到了120 d时，T3处理的虫口减退率则显著低于T4的，说明微生物菌肥对土壤线虫的抑制持久性与施用水平呈正相关性。在同一处理中，随着施肥后时间的延长，4个处理的虫口减退率均表现出先升后降的变化趋势，均在施肥后80 d达到顶峰，之后皆有所下降；施用120 d时，与80 d相比，T4虫口减退率下降2.1%，T3下降3.2%，T1下降幅度最大，达到8.7%。说明微生物菌肥要发挥最大的作用需要一定的时间，但超过一定的时限后对罗汉果根结线虫抑制作用出现衰减，施肥量较大的处理比施肥量小的衰减幅度小。在采收后，对植株根部受害情况的调查结果显示，根结发病株率、病情指数均有随着施肥水平的提高而降低，各处理间的差异达到显著水平。以T4处理的相对防效最高，达到77.14%。

2.2 微生物菌肥对土壤酶活性的影响

脲酶广泛存活于土壤中，参与有机氮的转化，其活性增强促进有机氮的水解和吸收。试验发现，施用微生物菌肥后，根围土壤的脲酶活性在一定程度上得到增强，在不同时期所表现的活性不尽相同。在施用后40和80 d时，各处理的脲酶活性均显著高于对照，并随着施用量的增加呈先增后降的趋势，其中以T3处理的活性最高。随着时间的推移，在施肥后120 d时，T4土壤脲酶活性反高于T3处理的，表现为随着施肥水平的增加而升高，两者差异不显著，但此时T1处理的脲酶活性已与CK基本持平（表2）。反映出在一定时间内，适量的菌肥有利于持续提高根际土壤的脲酶活性。

表1 微生物菌肥对罗汉果根结线虫的发生调查表

磷酸酶为土壤中重要的作用酶之一，能促进有机磷化合物或无机磷酸盐转化，有利于植物对磷的吸收、利用。结果表明（表2），微生物菌肥能促进根际土壤磷酸酶活性的提高，磷酸酶活性随着菌肥施用量的增加呈先升高后降低的变化趋势，其中以T3处理较好，表现为在施用后80和120 d土壤磷酸酶活性均最高，其中在120 d时显著高于对照和其他处理；其次为T2，T2表现为速效、早退，在施用后的40 d土壤磷酸酶活性较高，至80 d时磷酸酶活性也显著高于CK、T1和T4处理，但与T3处理的差异未达到显著水平；至120 d时T2酶活性显著低于T3。T4处理表现为迟效，在施用后120 d磷酸酶活性呈现提升的态势，与T2处理基本持平。说明中等量的微生物肥更有利于磷酸酶活性的提高。

表2 施用微生物菌肥对罗汉果土壤酶活性的影响

过氧化氢酶是土壤中的氧化还原酶之一，有助于过氧化氢的分解，降低土壤有害物质对生物体的毒害作用，其活性可反映出土壤腐殖质化程度和有机质转化速率。从试验结果（表2）可看出，在施用菌肥后的40、80、120 d，各处理的根际土壤过氧化氢酶活性均显著高于对照，且均随着微生物菌肥施用量的增加而升高，但不同时期各施肥处理的差异性不同。在施后40 d时，各处理之间差异不显著；在施用后80 d时，以T4处理的过氧化氢酶活性最高，其次为T3处理的，二者之间差异不显著，但显著高于T1、T2；至120 d时，仍以T4处理最高，显著高于其他处理。说明微生物菌肥可提高过氧化氢酶活性，随着处理时间的延长，不同施肥水平下过氧化氢酶活性不同，水平越高酶活性越高。

2.3 微生物菌肥对罗汉果产量和硒富集的影响

市场上，罗汉果以果实大小定价，以个数计效益；在提取加工中，则以果实重量来算收，因此，结果数、中大果比率和果实重量均为罗汉果产量构成主要因素。试验结果（表3）表明，施用微生物菌肥能促进罗汉果结果，结果数随着施肥水平的提高而增大，以T4最高，显著高于其他处理，与对照相比结果数提高37.6%。单果重也有随着施肥水平的提高而增大，以T4处理为最大；其次为T3处理，T4和T3之间差异不显著，但均显著高于T2、T1处理；与对照相比，增加幅度达到24.4%。中大果比率随着肥料水平的提高呈现先增加后降低的变化趋势，以T3处理最高，与对照相比提高12.9%。其次为T4处理，两者之间差异不显著，但均显著高于其他处理。可以看出，微生物菌肥能增加罗汉果结果数和果实重量，一定施用水平能提高中大果比率。

硒是人体必需的微量元素，是人体抗氧化酶和硒蛋白的重要组成部分［12］，具有抗脂质过氧化、保护生物膜、抗肝损伤的作用［13］，同时有提高人体免疫力和抗病毒感染的能力，在防治克汀病、心脑血管疾病、癌症、肝病、糖尿病等方面均有较好的疗效［14-15］。富硒罗汉果对肝脏具有较好的保护作用，综合保健功能较好，倍受当今消费者的青睐。实验结果表明，施用本试验自主研制的改良型微生物菌肥，能显著促进罗汉果对硒的富集，富集量随着施肥水平的提高而增加，以T4最高，其硒含量达到1.02 mg/kg，是对照的18倍，产品均符合《富硒农产品硒含量分类要求》［16］之中药材的要求，该标准中规定富硒中药材含硒应为0.15～2.0 mg/kg。

3 讨论

表3 微生物菌肥对罗汉果果实产量和硒含量的影响

根结线虫病是一类危害大、分布广、防治难的植物病虫害，其发生是造成作物减产的直接原因，也是土壤质地变差，引发连作障碍的重要表征。以往高毒、高残留的防治方法，严重阻碍了“绿色”农业的发展。寻找环境友好型的根结线虫病防控技术是发展有机农业的必经之路。利用植物源活性物质防治植物寄生线虫的研究逐渐受到重视和广泛关注［17］，已有研究报道称，许多植物对南方根结线虫有毒杀作用［18］。本试验中，使用的微生物菌肥以桐麸、油茶麸和蓖麻籽粉为基础物质，含有生物碱、蓖麻毒蛋白和茶籽醇成分，对南方根结线虫病有明显的抑制作用，与前人［19-21］的研究结果相一致，也验证，有机肥料本身或在腐解过程中产生有毒的次生代谢物质，可致使土壤病原物死亡［22］。

人为添加的有益菌能快速培养形成优势菌群，直接致使土壤病原物死亡［23］，且能改变土壤微生物的营养结构，导致微生物间竞争、捕食关系加剧，对土传病原物起到竞争和拮抗的作用［24］。此外，某些生物菌之间存在着协同作用［25］，加强了菌功能的作用效应。本试验中，主要有益生物菌长柄平菇菌（Plurotusspodoleucus）和枯草芽孢杆菌（B．subtilis）协同作用，增强生物菌对罗汉果生长和根结线虫病的抑制作用，与蒋妮［26］、丁国春［27］等研究结果相同。

利用功能性植物和微生物菌搭配制作而成的微生物菌肥，不仅能能植物本身活性成分或腐解过程分泌的有毒物质与功能微生物菌共同作用以抑制南方根结线虫，又能为作物生长提供养分，改善土壤环境，活化肥素，促进作物生长，对罗汉果高质量生产具有十分重要的意义。