拟南芥MAPKKK16酵母双杂交诱饵载体的构建及毒性和自激活效应检测

雷柯煜 邓治 吴文冠 程汉

(1海南大学园艺学院海南海口570228;2中国热带农业科学院橡胶研究所海南海口571101)

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）级联途径由丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶组成，能被各种细胞外刺激激活［1］，通过磷酸化逐级活化将胁迫信号级联放大，传递至下游的靶蛋白，从而引起一系列生理生化反应。真核细胞都可以表达MAPK，其通路是由一种保守的三级激酶模式组成，即MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK［2］，通过蛋白质磷酸化作用将上游信号级联放大传递至下游应答分子，从而激活抗逆基因的表达，使植物对逆境有一定的适应能力。MAPKKK是MAPK级联途径之中的组成部分，在植物生长发育及非生物胁迫响应过程中起着重要的作用［3-4］。

前期通过转录组分析方法比较了橡胶树抗寒品种93-114和低温敏感材料热垦501间的基因表达差异，发现一个MAPKKK基因在橡胶树抗寒品种中表达水平很高，而低温敏感材料中几乎不表达，推测MAPKKK可能在橡胶树抗寒能力形成中具有重要作用［5-8］。通过同源比对发现，该橡胶树MAPKKK和拟南芥MAPKKK16高度同源，且拟南芥MAPKKK16功能并未被鉴定，限制了该基因进一步研究。橡胶树作为研究对象培育时间长、操作复杂，且橡胶树转基因体系不够成熟［9］，为了深入理解橡胶树MAPKKK基因功能，寻找行之有效的研究方法，利用模式植物同源基因分析鉴定来研究橡胶树MAPKKK基因。前期对拟南芥MAPKKK16的功能进行了初步分析，发现其能够调控植物的抗寒能力（未发表资料）。在此基础上，将拟南芥MAPKKK16基因完整编码区插入酵母双杂交诱饵载体，成功构建诱饵载体pGBKT7-MAPKKK16，将重组质粒pGBKT7-MAPKKK16转化至酵母Y2HGold感受态细胞，检测诱饵蛋白的毒性和自激活活性，为后续筛选AtMAPKKK16互作蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所需T4连接酶、Sma I限制性内切酶来自于NEB公司，高保真酶Prime STAR、缺陷型培养基、X-α-gal购自Takara公司，酵母细胞完全转化试剂盒为上海杰美基因医药科技有限公司产品。引物合成及测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。拟南芥植株、pGBKT7载体、酵母菌株Y2HGold及Y2HGold［pGBKT7-53］+Y187［pGADT7-T］（正 对 照）和Y2HGold［pGBKT7-Lam］+Y187［pGADT7-T］（负对照）均来自于实验室内保存提供，大肠杆菌DH5α感受态购自于全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥基因组DNA提取

参照陈相等方法［10］快速提取拟南芥基因组DNA。

1.2.2 拟南芥MAPKKK16基因的扩增和诱饵载体pGBKT7-MAPKKK16的构建及鉴定

根据AtMAPKKK16基因序列并结合多克隆位点及酵母表达载体阅读框，通过软件BLAST分析设计引物，上游引物16F序列为5’-GATGGAGATTAATTGGACAAG-3’，下游引物16R序列为3’-GACTTGGTTAGTGAATTTAAC-5’，以拟南芥基因组DNA为扩增模板。

使用限制性内切酶Sma I将通过试剂盒回收的目的片段和pGBKT7进行酶切的同时，加入T4连接酶连接。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行PCR扩增，上游引物BDF序列为5’-CATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCT-3’，和下游引物16R序列为3’-GACTTGGTTAGTGAATTTAAC-5’，1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性单克隆菌落送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。

1.2.3 酵母感受态细胞的制备和转化

使用上海杰美基因医药科技有限公司的GENMED小量酵母细胞完全转化试剂盒制备酵母感受态制备及转化：将冷冻保存的Y2HGold划线至YPDA平板上，28～30℃培养48～72 h，挑取单克隆菌落至10 mL YPDA液体培养基中，放入摇床，250 r/min摇菌48 h，分光光度计检测菌液OD600值在1～2。根据试剂盒中的说明书操作，得到的感受态在4℃保存备用［11-12］。

将测序结果正确的阳性单克隆菌落接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中（10 mL），在37℃200 r/min摇床中震荡培养过夜，提取质粒。将重组质粒pGBKT7-MAPKKK16和阴性对照质粒pGBKT7各取3μg分别加入2管制备好的酵母感受态细胞中，按照试剂盒中的说明书进行操作，将转化产物均匀铺板在SD/-Trp琼脂平板上，30℃恒温培养2～5 d，直至菌落长出。

1.2.4 诱饵重组质粒pGBKT7-MAPKKK16的毒性检测

在SD/-Trp平板上分别挑取诱饵重组质粒pGBKT7-MAPKKK16和阴性对照质粒pGBKT7转化后的酵母单菌落，进行菌落PCR检测，鉴定转化是否成功。将阳性单克隆菌落分别置于20 mL SD/-Trp液体培养基中，在30℃25 r/min摇床中震荡培养2～3 d。取100μL的菌液，并以未接种的SD/-Trp液体培养基为空白对照，使用分光光度计测得菌液的OD600值，鉴定诱饵蛋白对酵母细胞是否有毒性［13-15］。

1.2.5 诱饵重组质粒pGBKT7-MAPKKK16自激活效应检测

将转化的新鲜诱饵重组质粒pGBKT7-MAPKKK16与空载体pGBKT7酵母菌液均匀涂布在SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp/x-α-gal平板上，并将Y2HGold［pGBKT7-53］+Y187［pGADT7-T］和Y2HGold［pGBKT7-Lam］+Y187［pGADT7-T］分 别作为正负对照，30℃培养2～3 d后观察酵母生长情况。

2 结果与分析

2.1 拟南芥MAPKKK16基因序列的分析

在NCBI数据库中以橡胶树MAPKKK序列为查询序列进行blast比对，发现拟南芥MAPKKK16基因（At4g26890）与之同源。将AtMAPKKK16序列输入NCBI的ORF Finder程序，发现长度为1 335 bp的ORF，推测该序列编码444个氨基酸。（图1）通过比对，发现无内含子。

图1 AtMAPKKK16核苷酸序列及其氨基酸序列

2.2 拟南芥MAPKKK16基因序列的克隆及诱饵载体pGBKT7-MAPKKK16的构建和鉴定结果

以拟南芥基因组DNA为模板，在50μL的反应体系中进行PCR扩增，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到扩增目的片段与预期1 335 bp大小一致，并且没有非特异性扩增（图2）。通过电泳凝胶回收纯化试剂盒回收目标条带。

图2 拟南芥MAPKKK16基因PCR扩增1%琼脂糖凝胶电泳检测结果

经过Sam I和T4连接酶同时酶切和连接构建重组质粒pGBKT7-MAPKKK16，然后将重组质粒转入大肠杆菌感受态DH5α的后，在含有卡纳青霉素抗性的LB平板上挑取多个单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定，通过电泳检测，目的片段大小为700 bp左右，与预期大小一致（图3）。将阳性单克隆菌落送去上海生工公司测序鉴定，测序结果经软件DNAMAN分析，证实插入序列与拟南芥MAPKKK16序列完全一致且方向正确，表明诱饵载体pGBKT7-MAPKKK16构建成功。

2.3 诱饵载体的转化及毒性检测结果

将pGBKT7-MAPKKK16质粒和pGBKT7空载体转化酵母Y2HGold感受态后，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp平板上，结果诱饵载体和空载体对照在SD/-Trp平板上长出菌落，在SD/-Leu/-Trp平板上没有长出菌落（图4）。挑取SD/-Trp平板上的单菌落做菌落PCR鉴定，证明诱饵载体和空载体已成功转入酵母Y2HGold中，将阳性单克隆菌落放入SD/-Trp液体培养基中培养2 d后，在分光光度计中检测，含有诱饵载体的菌液OD600值为1.228，含有空载对照菌液OD600值为1.067，OD600均大于0.8，说明表达蛋白对酵母菌无毒性。

图3 重组质粒pGBKT7-MAPKKK16菌落PCR的鉴定结果

2.4 诱饵载体自激活检测结果

设置正、负、空载体3个对照并和诱饵载体同时在SD/-Trp/x-α-gal平板上点板，每个样品吸取5μL菌液点在平板上，30℃过夜培养。结果显示正、负对照、空载体和诱饵载体均能在SD/-Trp/x-α-gal平板上正常生长，但正对照变蓝色菌落，负对照、空载对照和诱饵载体为白色菌落（图5），表明诱饵载体没有自激活活性。

图4 诱饵载体转化酵母结果

图5 诱饵载体在SD/-Trp/x-α-gal平板上自激活检测结果

3 讨论

天然橡胶是国家的战略物资，在国防、航天等高端设备以及日常生活中广泛应用。我国种植的橡胶树原产于热带地区，在我国种植区培育会面临低温、干旱、生物胁迫等问题，因此研究抗寒、抗旱、抗病虫害且高产的品种更为迫切［16-19］。前期发现橡胶树MAPKKK基因与橡胶树抗寒相关，但目前橡胶树转基因系统尚不成熟，对橡胶树转基因的直接研究存在着耗时长、材料获取复杂等问题，因此为研究橡胶树抗寒基因MAPKKK，寻找模式植物中的同源基因。在拟南芥中找到与橡胶树MAPKKK高度同源基因MAPKKK16，对拟南芥MAPKKK16进行互作研究，为橡胶树相关的抗逆研究奠定基础。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）包括三级信号传递过程，即MAPK，MAPK激酶及MAPK激酶激酶，通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥着重要作用。目前关于拟南芥MAPK的研究很多，MAPKKs和MAPKs之间相互作用的研究也有不少的报道，但是没有发现关于拟南芥MAPKKK16的研究和报道。于是实验室前期对拟南芥MAPKKK16基因的功能进行了初步研究，发现该基因与拟南芥抗寒有关。为筛选MAPKKK16基因互作蛋白，本研究利用酵母双杂交系统构建了MAPKKK16诱饵载体，并对其自激活活性和毒性进行检测。

酵母双杂交技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白与蛋白之间的相互作用，被广泛用于多种领域，具有敏感性高、操作便捷等优点，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一。但同时酵母双杂交系统存在局限性，经常遇到的问题就是假阳性高，产生假阳性的原因有很多，例如某些蛋白本身具有激活或转录功能，使DNA结合结构域杂交蛋白（BD-bait）在无特异激活结构域的情况下可以激活转录，产生假阳性的结果。实验常通过检测诱饵蛋白能否单独激活报告基因，以降低假阳性产生的误差。

本实验成功构建了拟南芥pGBKT7-MAPKKK16诱饵载体，并证明该诱饵载体对酵母无毒性和无自激活作用，可进行后续的互作研究，可为拟南芥MAPKKK16互作蛋白筛选奠定基础。在找到并且鉴定拟南芥MAPKKK16的互作蛋白后，对橡胶树MAPKKK基因的互作研究提供科学依据。