罗丹明类荧光探针进行小分子信标物标记的研究进展*

成 昭，雷淑林，杨丽平

[1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.西京医院(空军军医大学第一附属医院) 体检中心，陕西 西安 710032]

自然界中的荧光现象与生物传感普遍存在，生命体内源性荧光是进行分子荧光标记研究的基础。继20世纪50年代生命体内源性荧光分子被陆续发现以来，物理学、化学、生物学等各学科研究人员通过对生命体自发荧光与生物传感现象进行借鉴、模仿，完成了分子标记、生物化学传感器等领域的许多研究工作。在分子标记领域中，小分子荧光探针的出现，相比传统检测方法如同位素标记、原子吸收等，极大地提升了标记工作的特异性、响应性及实时成像性，得到迅速发展。其中，罗丹明类荧光探针在小分子信标物的荧光标记研究中表现良好、应用前景广泛。

1 小分子信标物的荧光探针标记法

1.1 生物自发荧光与模拟生物传感

1957年，Teale与Weber[1]发现一些含芳环的氨基酸，如色氨酸(tryptophan，Trp)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)及苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，能够被特定波长的光激发，从而发射特征荧光信号。其中，Trp荧光性最强、对环境反应敏感，现常以Trp作为内源性荧光探针，研究蛋白质结构、构象及功能等。其他的内源性荧光分子还包括黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)、黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)，以及负有盛名的荧光蛋白。自1962年Shimomura[2]首次发现维多利亚多管发光水母中的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)以来，其相关研究发展迅速，荧光蛋白成像现已作为一种临床检测手段、被广泛应用于肿瘤成像中。

分子标记[3]、生物化学传感器[4]领域的相关研究工作，在一定程度上借鉴和模仿了生命体自发荧光与生物传感现象。通过识别体系构筑与荧光信号输出，将发生于分子水平的探针-待标记物识别过程进行可视化呈现，使活体细胞环境的生物化学过程示踪与小分子信标物标记研究成为可能。

1.2 化学标记技术的发展

聚焦于某种小分子信标物、进行高选择性检测，需要根据目标物特性进行探针的靶向设计[5]，使得探针可与目标物发生特异性识别，并可通过一定的检测技术探知这种识别作用或过程。区别于一般的检测手段，荧光探针在识别体系构筑与荧光信号输出方面具有诸多优势，可基于电子转移、化学反应或分子间弱作用进行靶向识别体系设计，还可基于光信号、磁信号、电化学信号及质量敏感信号等物理学手段输出目标物标记信息，能够满足实际工作中的分析检测要求。

化学标记是一种可应用于生物分析和化学分析的重要方法，根据标记手段和检测技术的差别，探针被分为放射标记探针和非放射标记探针，而其中最为人们所熟悉的2种探针形式是放射同位素标记探针与荧光标记探针。放射标记探针使用放射性同位素进行目标物的标记，应用较早，但受限于检测技术，商品化困难。非放射标记以荧光标记最为常见，常借助于在紫外-可见光区或红外光区[8]表现光吸收与荧光性质的荧光染料分子实现标记，再辅助以各类显微成像与荧光检测技术，如紫外-可见光谱、荧光光谱、荧光显微镜、激光共聚焦荧光显微镜等，以实现分子水平[9-10]、细胞水平的目标物荧光标记检测。在现阶段对生命体中小分子信标物的标记研究中，荧光探针标记技术发展迅速，无论荧光检测仪器发展或荧光探针结构构筑、新型荧光发色团合成，均取得较大进展。

2 荧光探针结构设计与罗丹明类荧光发色团

2.1 荧光探针结构设计

荧光探针设计主要基于3种结构类型，键合-信号输出型、置换型、化学计量型(见图1)，也存在一定数量的反应型探针，通过化学反应、实现置换或化学计量，进而完成目标物的识别与检测。

图1 荧光探针结构设计的主要类型

2.1.1 键合-信号输出型荧光探针

键合-信号输出型荧光探针是应用最为广泛的探针类型，其结构特点是通过连接体，以共价键连接探针结构中的荧光基团与识别基团。识别基团结合目标物后，因分子结构的改变，使荧光基团的光学信号输出发生显著变化，进而实现检测。

2.1.2 置换型荧光探针

置换型荧光探针，基于识别基团对荧光基团、目标物的结合强度差别进行结构设计，一般情况下，识别基团与目标物结合能力较强，识别基团与荧光基团结合能力相对较弱，使得原本连接在识别基团上的荧光基团可被目标物置换，发生荧光信号输出的改变，实现检测。

2.1.3 化学计量型荧光探针

化学计量型荧光探针利用探针分子与目标物之间的特征反应或相互作用，通过探针对目标物识别作用前后、体系荧光信号的差别(如荧光激发/发射波长位移、荧光强度强弱等)，实现目标物检测。近年来，化学计量型荧光探针因其在目标物检测中良好的定量效果以及对目标物的特异性识别作用得到关注。针对不同目标分子检测的化学计量型荧光探针被不断合成得到，但基于探针与目标物之间的特征反应或相互作用进行目标物检测，探针与目标物两者之间的结合能力往往较强、或不可逆地发生两者间的结合作用，应用于生命体中目标物检测时，化学计量型荧光探针具有一定局限性，对于动态变化的目标物、检测程度有限。

2.2 罗丹明类荧光发色团

罗丹明是一种基于吡喃型氧杂蒽母体的碱性咕吨染料，因其结构中的长共轭链与刚性平面结构，而表现良好荧光性能[11]。其特性之一在于罗丹明是一种长波激发与发射的荧光发色团，合成之初作为染料被用于织物染色。罗丹明及其衍生物的最大荧光激发与发射波长多处于可见光区，呈现强烈荧光、光学性质稳定，进行光学性能分析时背景荧光干扰较少；另一特性在于罗丹明结构的可修饰性强、衍生物种类众多，均基于氧杂蒽环母体、进行官能团修饰得到。氧杂蒽环母体的取代基对其光吸收及发射特性具有强烈影响，罗丹明衍生物因此具有不同的光学表现，满足各类目标物的荧光标记与检测需求，常见于罗丹明6G[12]、罗丹明B[13]、罗丹明123[14]、罗丹明800[15-16]、罗丹明101[17]、德克萨斯红[18-19]等(见图2)。

图2 代表性的罗丹明衍生物

优化合成路线、改善水溶性、提高对目标物的键合能力，是进行罗丹明改性修饰及开发多种罗丹明衍生物的主要目的，从而使罗丹明衍生物能够适用于化学、生物学、医学等多学科领域与实际工作不同需求的荧光标记研究。例如，罗丹明6G、罗丹明123及罗丹明B是应用广泛的荧光探针，罗丹明101常用于酶活性研究，罗丹明800和德克萨斯红多用于生物染色分析。Horneffer等[19]还将德克萨斯红用于基质辅助激光解吸/电离(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)蛋白质的荧光标记与定位，借助于德克萨斯红荧光信号对pH相对稳定的特性，克服酸性检测环境可能引发的荧光猝灭等实验干扰。

2.3 基于长波激发/发射的罗丹明结构修饰

短波激发/发射的荧光探针，分子结构相对简单，应用于生命体小分子信标物测定时，因其低分子量而呈现较好的膜通透性，但无法避免细胞中蛋白质、核酸等大分子的自身荧光发射和细胞的光散射干扰，影响测定结果的准确性。为了移除紫外光激发探针在实际测定时的背景干扰，可见光激发及近红外光激发等长波激发探针发展迅速。

其中，最大吸收与发射波长均处在650～900 nm的荧光探针，在生命体小分子信标物的动态荧光成像中具有重要意义。650～900 nm可见光及近红外光透过皮肤和组织时，仅引发微量细胞自发荧光，同时，近红外区荧光信号散射性极低，因上述两点造成的测定偏差几乎可被忽略，所以近红外区荧光探针分子具有良好应用前景[20]，吸收/发射波长处于近红外光区的罗丹明类探针近年来发展迅速，对罗丹明结构中的氧杂蒽进行修饰，已获得一系列近红外罗丹明类探针，探针分子1、2、3见图3。

图3 长波激发/发射的罗丹明衍生物1、2、3

Lin课题组[21]报道了一类经过结构修饰、有效增大π共轭体系的长波激发/发射罗丹明探针4(见图4)，相比罗丹明B母核，探针4的最大发射波长增幅超过150 nm，各项荧光特性参数良好，具有较大的摩尔吸光系数和荧光量子产率。引入吲哚等吸电子杂环后，9-位苯环取代物仍具有目标物识别特性、表现与罗丹明螺环结构类似的开-关环转换，具有很好的应用前景。

图4 近红外发射的罗丹明衍生物探针4

3 用于小分子信标物标记的罗丹明荧光探针

罗丹明及其衍生物作为开-关形式的荧光探针，具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、表现可见光区至近红外光区长波激发/发射等特性。根据特定小分子信标物的结构特点，构筑罗丹明探针的识别体系，得到对目标物呈现特异性检测的罗丹明荧光探针，相关研究及应用发展迅速。

3.1 用于金属离子标记的罗丹明荧光探针

1997年，Czarnik等[22]首次利用罗丹明中螺环的开、关环机理设计了Cu2+荧光探针5(见图5)，之后相继出现用于Hg2+、Zn2+、Ag+、Pt2+、Pd2+、Au3+、Cr3+等金属离子信标物检测的罗丹明类荧光探针，多基于罗丹明衍生物中螺环的开环、关环机理进行结构设计。

图5 首个罗丹明Cu2+荧光探针5

3.1.1 Fe3+罗丹明荧光探针

Fe是人体中含量最高的过渡金属。Fe在生命体中的存在形式既有Fe2+(ferrous)也有Fe3+(ferric)，与生命体氧化-还原代谢水平密切相关。研究发现，随着人年龄增长，脑部Fe含量存在尚不明确机制的积累[23-24]，因此，进行人体内Fe的标记和追踪对于其生理作用的进一步阐明具有重要意义。此外，Fe的荧光标记示踪还需要区分Fe2+与Fe3+2种氧化态形式。多种罗丹明荧光探针对高氧化态Fe3+表现良好的识别性能。

相对于Fe3+传统检测方法，如基于Fe3+与[Fe(CN)6]4-反应而生成Fe7(CN)18·xH2O的普鲁士蓝组织染色法[25-26]、放射性同位素59Fe示踪、以及基于57Fe的Mössbauer光谱法[27]，罗丹明荧光探针，能够选择性识别Fe3+，克服了传统方法灵敏度不高、毒性大、测试干扰以及需要样品固定等缺点，并在选择性、光学性质以及生物相容性方面表现诸多优势。

代表性的罗丹明Fe3+荧光探针如化合物6(见图6)，以二亚乙基三胺连接2个罗丹明骨架得到，表现内酰胺分子开-关环的可逆转化平衡[28]。探针分子6[29]结合Fe3+后，无荧光发射的内酰胺转化为其开环形式、发射荧光信号(λex=510 nm，λem=575 nm)。探针6在水溶液中能够高选择性地识别Fe3+，与Fe3+具有中等结合强度(Kd=316 μmol/L)。

图6 Fe3+罗丹明荧光探针6

3.1.2 Cu2+罗丹明荧光探针

Cu位于人体过渡金属含量排序的第3位[30]，类似于元素Fe，Cu也主要存在亚铜离子Cu+(cuprous)与铜离子Cu2+(cupric)2种氧化态，参与氧化还原反应、呈现动态及不均匀的分布。由于Cu的氧化还原特性，Cu是许多酶体系中不可缺少的辅因子，如细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，CcO)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，SOD1)等。

同时，由于Cu2+较强的配位能力，Cu动态平衡异常也被越来越多地证明与许多神经退化性疾病相关，如阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s Disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson′s Disease，PD)、肌萎缩侧索硬化病(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、门克斯病(Menkes Disease)、威尔逊病(Hepatolenticular Degeneration，HLD)等[31-33]。Cu的广泛分布、因维持正常生理机能而具有的流动性，以及其不正常的调控作用与一系列神经退化性疾病的关系，需要从神经生理学和神经病理学的角度作以解释。这些工作的首要前提是实现Cu的标记与追踪，并能够实现对其2种主要氧化态Cu+(4s23d10)与Cu2+(4s23d9)的准确区分。而传统的67Cu同位素标记法[34]及原子吸收光谱法[35]，缺乏细胞水平上的空间分辨，且无法区分Cu+和Cu2+。

Cu2+罗丹明探针7(见图7)基于内酰胺环开-关环与相应荧光强度变化进行Cu2+响应，结合Cu2+之后，罗丹明的开环形式在这种平衡中成为主体结构，荧光强度增加了9.4倍(λex=520 nm，λem=585 nm)，能够特异性选择Cu2+，选择性高、结合强度中等(Kd=14 μmol/L)。结合Cu2+可以改变闭环、无荧光内酰胺形式与开环、强荧光罗丹明形式的平衡。

图7 Cu2+罗丹明荧光探针7

Czarnik等设计以Cu2+作为催化剂、催化有荧光产物生成的一类不可逆水解反应，通过对该种荧光产物的特征性荧光信号检测，间接实现Cu2+检测(见图8)。路线设计初期，Czarnik等尝试以Cu2+催化水解α-氨基酸[36-37]，得到罗丹明B酰肼衍生物的探针结构(化合物8)。Cu2+催化下，罗丹明母核结构快速水解，得到其酸性荧光形式[22]。在体积比为1∶4的乙腈-水体系中，探针8与Cu2+的水解反应在1 min内即可完成，且具有高灵敏度与Cu2+特异性，催化剂Cu2+浓度小于10 nmol/L时也可发生，与竞争离子共存时、探针8仍然对Cu2+具有高选择性。其类似物为探针9(见图8)，对Cu2+表现类似的识别性能。

图8 不可逆的Cu2+化学计量罗丹明荧光探针8、9

3.1.3 Hg2+探针

Hg2+荧光探针10见图9，基于罗丹明的中位苯环修饰，Taki课题组[38]设计引入可容纳金属离子的多硫醚空腔结构，成功用于监测细胞线粒体的Hg2+浓度。

图9 Hg2+罗丹明荧光探针10

3.2 用于阴离子标记的罗丹明荧光探针

生命体中的微量ClO-主要表现杀菌作用，一旦过量则会破坏免疫系统。Tae课题组[39]报道了基于罗丹明内酰胺衍生物的ClO-荧光探针11(见图10)，能够完成体外活细胞环境的ClO-浓度动态监测，具有进一步用于生物体ClO-有效检测的临床前景。罗丹明内酰胺环呈现空间螺旋结构、具有一定的结构张力，结合ClO-后，内酰胺环的氮原子质子化、电荷密度减少，引发螺旋中心的C—N键开裂，同时，断键后富电子螺环将进行电荷重排，形成更稳定的刚性平面大π键结构，表现荧光信号输出的变化、并伴有颜色改变，实现ClO-检测。

图10 ClO-罗丹明荧光探针11

3.3 用于中性小分子标记的罗丹明荧光探针

改变3-、6-位氮原子的供电子能力，也是设计罗丹明类荧光探针的一种常见方法。唐波课题组[40]设计得到了一种含Se—N键、对含巯基化合物表现特征响应的荧光探针12(见图11)，成功用于细胞内硫醇的荧光成像。探针结构中，罗丹明6G母核的3-位氨基形成Se—N键、荧光淬灭，而硫醇(RSH)的亲核进攻使Se—N键断裂，在还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)作用下，重新释放出表现强烈荧光信号的罗丹明6G，实现含巯基化合物的中性小分子检测。

图11 含巯基化合物的罗丹明荧光探针12

此外，还有用于自由基捕获的罗丹明类荧光探针[41]、罗丹明类pH荧光探针[42]等，已被合成得到，并广泛用于体外活细胞环境的标记检测、小动物成像等领域，在小分子信标物的异常监测与分析、疾病预判等临床实际问题中得到了初步应用。

4 结束语

荧光是一种光致发光现象，根据荧光产生机理、荧光寿命等特征光学参数可知，荧光信号发射迅速，基于荧光检测的荧光探针技术也具有响应迅速的特性。相比生命体中小分子信标物的传统检测方法如同位素标记、原子吸收等，荧光探针在特异性、透膜性、低毒性、迅速响应及实时成像方面性能优良，辅助以共聚焦荧光成像技术时，探针可聚焦至亚细胞单元甚至细胞器水平的小分子信标物动态变化，进一步放大微观信号。基于罗丹明母核结构得到兼具长波激发/发射与可视化检测特性的荧光探针，因结构可修饰性强、衍生物种类众多，可合成得到针对多种目标物以及适用于多种检测要求的罗丹明衍生物探针。进行生命体中目标小分子信标物的荧光标记与检测时，相应探针能够特异性识别目标物，给出特征荧光信号、指示识别过程，实现生命体中小分子信标物的实时示踪与动态变化成像。

以荧光探针技术进行小分子信标物的示踪分析，初步实现信标分子的异常监测、指导疾病诊断等临床实际应用问题，是目前荧光探针进行生命体中小分子信标物荧光标记及成像的主要趋势。