高效液相色谱法测定饮料中防腐剂的含量

刘志忠，袁 姗，高明珠

（1中国乐凯集团有限公司 河北 保定 071054）

（2乐凯胶片股份有限公司 河北 保定 071054）

1 引言

食品防腐剂能抑制微生物的活力，防止腐败，延长食品的保质期[1]。大多数饮料和包装食品需要长时间保存，需要添加食品防腐剂[2]。食品防腐剂也是一把“双刃剑”，可能会给人们的健康带来一些问题，能够快速识别和准确量化饮料中的防腐剂是非常重要的[3]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（1260），美国安捷伦公司；3680A超声波清洗机，上海昆山仪器公司；AP系列无油真空泵，天津ORENT仪器有限公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计，上海普析通用仪器有限责任公司；HH-4数显双列四孔恒温水浴锅，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；FA1204B电子天平，上海天美科学仪器有限公司；移液器，Ldragon公司。

甲醇（色谱纯），北京百灵威科技有限公司；乙腈（色谱纯），天津市永大化学试剂有限公司；异丙醇（光谱分析纯），北京百灵威科技有限公司；醋酸铵（分析纯），天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司；碳酸氢钠（分析纯），天津标准科技有限公司；氨水（分析纯）永飞化学试剂有限公司；苯甲酸（分析纯），麦克林试剂公司；山梨酸（分析纯），麦克林试剂公司。

2.2 溶液的配制

2.2.1 标准品的配制

用分析天平准确称取苯甲酸和山梨酸钠于烧杯中，加入碳酸氢钠溶液（20g/L）5mL，并加入50mL的纯净水，将烧杯置于80℃水浴锅中，并震荡至固体完全溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容，摇匀得到1.0mg/mL的苯甲酸和山梨酸储备溶液。将上述溶液稀释，得到0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L的混合标准溶液。

2.2.2 缓冲溶液的配制

用电子天平准确称取乙酸铵（表1），配制一系列不同浓度的乙酸铵缓冲溶液。

表1 乙酸铵缓冲溶液的配制Table 1 Preparation of buffer solution of ammonium acetate

2.3 样品的预处理

市售饮料开盖后放入超声波水浴中，进行30分钟超声波脱气，去除饮料中气体。再用无油真空泵进行减压抽滤，除去饮料中的杂质。

分别准确量取预处理过的6种饮料50mL于100mL小烧杯中，用氨水（1+2）调pH，并用精密pH试纸测量其pH，当pH为6.8时，将混合液全部转移至100mL容量瓶中，加水定容、摇匀，再用0.45μm滤膜过滤至样品瓶中。

2.4 色谱条件优化

2.4.1 检测波长的优化

在wavelength中设定扫描范围为200～400nm，在样品光路中的比色皿中分别放入山梨酸类和苯甲酸类溶液，点measure进行测定，得到苯甲酸和山梨酸类的紫外色谱图。

2.4.2 流动相比例的优化

以甲醇和0.02mol/L乙酸铵缓冲溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为230nm，柱温箱30℃，流动相的比例变化范围为甲醇：0.02mol/L乙酸铵=5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、45∶55、50∶50，通过观察色谱峰的形状和计算分离度来确定最佳的流动相比例。

2.4.3 色谱柱温度的优化

在甲醇：0.02mol/L乙酸铵=85∶15，检测波长为230nm，流速为1.0mL/min的色谱条件下，通过改变色谱柱的温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，通过观察色谱峰的形状和计算分离度来确定最佳的色谱柱的温度。

2.4.4 缓冲液浓度的优化

在甲醇：乙酸铵缓冲液=85∶15，检测波长为230nm，色谱柱温度为30℃，流速为1.0mL/min条件下，通过改变乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L，对乙酸铵缓冲液的浓度进行了优化，通过观察色谱峰的形状和计算分离度来确定最佳的缓冲液浓度。

2.5 标准曲线的绘制

设置色谱条件为：进样量为10μL，流速为1.0mL/min，流动相为甲醇：0.02mol/L乙酸铵，色谱柱温度为30℃，检测波长为230nm，对不同浓度的山梨酸和苯甲酸类的混合溶液进行峰面积的测定，分别以山梨酸和苯甲酸类的色谱峰面积为纵坐标，以山梨酸和苯甲酸类的浓度为横坐标进行作图，得到山梨酸类和苯甲酸类的标准曲线。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的确定

3.1.1 检测波长的确定

通过对苯甲酸类和山梨酸类溶液的紫外吸收光谱的测定得到了山梨酸类和苯甲酸类的紫外吸收光谱图（图1），发现苯甲酸类在200～275nm波长范围内具有紫外吸收，最大吸收波长在200nm处，山梨酸类在200～300nm的波长范围内具有紫外吸收，最大吸收波长在255nm处。在220～250nm范围内对检测波长进行了优化（图2），通过计算山梨酸类和苯甲酸类计算色谱峰之间的分离度，发现在检测波长设定为230nm时，苯甲酸类和山梨酸类的峰高、峰型最好，分离度能够达到两者完全分离的要求，因此确定检测波长为230nm。

图1 紫外吸收光谱图Fig. 1 Ultraviolet absorption spectrogram

图2 不同检测波长下山梨酸和苯甲酸类的色谱峰Fig. 2 Chromatographic peaks of sorbic acid and benzoic acid at different detection wavelengths

3.1.2 流动相比例的确定

实验选择甲醇和水作为流动相。在对流动相的比例进行优化的实验中发现不同比例的流动相对分离度、保留时间、峰形和灵敏度有较大影响，随着流动相中甲醇比例降低，山梨酸和苯甲酸类的色谱峰的分离度变大，保留时间变短，当流动相中，甲醇的比例为5%和10%时（图3），苯甲酸的色谱峰出现严重的拖尾现象，为了保证山梨酸和苯甲酸类有合适的分离度，且待测样品中山梨酸和苯甲酸类的色谱峰不受其他物质的干扰，确定流动相的比例为甲醇：0.02mol/L乙酸铵=15∶85。

图3 探究流动相比例光谱图Fig. 3 Spectrograms at different flow phase ratio

3.1.3 色谱柱温度的确定

实验对色谱柱的温度进行了优化，随着柱温度的升高，苯甲酸和山梨酸类的保留时间变短（图4），当温度在20～35℃范围内变化时，保留时间和分离度变化不大，但是分离度都能满足大于1.5，即山梨酸和苯甲酸类的色谱峰能够完全分离，本次实验的色谱柱温选择为30℃。

图4 不同柱温下山梨酸和苯甲酸的色谱图Fig. 4 Chromatograms of sorbic acid and benzoic acid at different column temperatures

3.1.4 缓冲液浓度的确定

通过向纯净水中加入乙酸铵作为缓冲溶液，并对缓冲溶液的浓度进行了优化（图5），发现当缓冲液浓度为0.01mol/L时，色谱峰形状较差，当缓冲液浓度在0.02～0.05mol/L范围内变化时，色谱峰的形状较好，半峰宽和分离度变化不大，由于缓冲液的浓度应尽可能低，因此选择缓冲液的浓度为0.02mol/L。

图5 不同缓冲溶液浓度下山梨酸和苯甲酸的色谱图Fig. 5 Chromatograms of sorbic acid and benzoic acid in different buffer concentration

3.2 精密度

在确定了的最佳实验条件下重复实验6次。苯甲酸类和山梨酸类的相对标准偏差分别为0.067%、0.032%（表2）。

表2 两种防腐剂的精密度的测定Table 2 Determination of the precision of two preservatives

3.3 标准曲线绘制

以山梨酸和苯甲酸类的质量浓度为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标进行绘图，得到山梨酸和苯甲酸类的标准曲线（图6）、（图7）和其线性回归方程（表3）。

图6 山梨酸类标准曲线图Fig. 6 Standard curve of sorbic acid

图7 苯甲酸类标准曲线图Fig. 7 Standard curve of benzoic acid

表3 线性回归方程表Table 3 Linear regression equation table

3.4 样品的测定

在最佳色谱条件下，对市售几种饮料进行了检测，通过标准曲线，计算样品中的苯甲酸类和山梨酸类防腐剂的含量（表4）。

表4 样品中防腐剂的含量表Table 4 Table of preservative content in sample

所测定的样品中防腐剂的含量均符合GB2760的规定。

4 结论

本文通过安捷伦1260型高效液相色谱仪，采用ZORBAX SB-C18色谱柱和可变波长检测器，建立了一种用高效液相色谱法同时测定饮料中常见的防腐剂：山梨酸类、苯甲酸类的检测方法，其相对标准偏差分别为0.032%和0.067%。该方法能够量化的测定饮料中山梨酸类和苯甲酸类防腐剂，避免了对人体健康产生不良影响，具有简便、快速、准确度高的特点。