不同温度下抑食金球藻、中肋骨条藻和海洋卡盾藻间的相互作用

郑承志, 左丽明, 马旺, 朱琴, 王火火, 吕颂辉, 陈亨, 黄凯旋

1. 暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心, 广东 广州 510632;

2. 水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室, 广东 广州 510632;

3. 河北省水文工程地质勘查院, 河北 石家庄 050021

抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)是一种直径2～3μm, 球形, 金褐色, 无细胞壁, 单个叶绿体, 细胞无鞭毛的海洋微藻, 归属于棕鞭藻门(Ochrophyta, 又称褐植藻门), 海金藻纲(Pelagophyceae)(DeYoe et al, 1997; 陈杨航 等,2015)。近些年来, 抑食金球藻曾在美国、南非和中国爆发大规模的藻华, 爆发海域呈褐色, 这种现象称为“褐潮”。褐潮的爆发对双壳类动物生长繁殖可造成毁灭性的打击。在我国河北秦皇岛自2009 年首次爆发以来, 曾连续四年多次爆发, 导致当地的扇贝生长停滞甚至死亡, 造成巨大的经济损失(Kong et al, 2012; Zhang et al, 2012)。

造成褐潮的爆发原因是多方面的, 已有一系列生理和生态调查阐述了褐潮爆发的机制(Mulholland et al, 2002; Dong et al, 2014; Kang et al, 2018)。除了物理和化学因素, 生物间的相互作用亦是褐潮发展和浮游植物竞争的重要因素。浮游植物种类间的相互作用可有效地阐述藻华的动态变化。微藻间的相互作用不仅体现为微藻对资源的竞争, 并可通过释放胞外化学物质促进或抑制其他种类, 这一过程称为化感效应。在褐潮爆发期共存的多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)与抑食金球藻可通过化感作用相互抑制生长(Chen et al, 2019)。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum) 和小球藻(Chlorella vulgaris)的培养过滤液亦能显著降低抑食金球藻的生长(毕相东 等, 2016; 张达娟 等, 2017)。通过藻种间的相互作用研究, 可更深入理解褐潮爆发前后浮游植物群落的动态变化, 并有助于生物抑制剂的开发(毕相东 等, 2016)。

浮游植物种类间的相互作用具有种类特异性,而抑食金球藻如何与该海域的其他赤潮爆发种的相互作用尚未可知。本文选取两株渤海主要的赤潮爆发种中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和海洋卡盾藻(Chattonella marina), 分别作为硅藻和甲藻的代表种, 研究它们与抑食金球藻在双藻混合和三种藻混合状态下生长的相互作用。已有研究表明中肋骨条藻可通过化感效应对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)、 血 红 哈 卡 藻(Akashiwo sanguinea)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)获取竞争的优势地位(Qiu et al, 2014; Wang et al, 2017)。产鱼毒性毒素的海洋卡盾藻亦能对链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)和血红哈卡藻具有化感效应(Fernández-Herrera et al, 2016)。考虑到主要的褐潮爆发期集中在5—8 月, 其温度变化波动在20℃至25℃之间, 因此本文设置了两个边界温度, 探讨在温变条件下生长的动态变化。

1 材料与方法

1.1 材料

抑食金球藻秦皇岛株于2011 年分离自秦皇岛海域, 中肋骨条藻以及海洋卡盾藻均由暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室提供。藻种培养于温度20℃, 光强100μmol photons m-2·s-1, 光暗周期比12h∶12h 的培养室中。传代接种所用培养基为L1 培养基配方(Guillard et al, 1993), 添加至经过滤灭菌的自然海水, 盐度为27‰。

1.2 实验方法

1.2.1 单种培养

藻种扩大培养后, 分别置于温度20℃和25℃的培养室进行培养, 其余培养条件与保种条件一致, 每个温度处理3 组平行。三种藻的初始密度分别为: 抑食金球藻为 20×105cells·mL-1, 中肋骨条藻 为 25×105cells·mL-1, 海 洋 卡 盾 藻 为2500cells·mL-1, 不同温度处理组的初始密度保持一致。每2d 进行细胞计数及叶绿素a 含量和叶绿素荧光测定。

1.2.2 共培养实验

共培养实验组一共分为3 组双藻种共培养和1组三藻种共培养, 具体如下: 混合1 为抑食金球藻与中肋骨条藻共培养; 混合2 为中肋骨条藻与海洋卡盾藻共培养; 混合3 为抑食金球藻与海洋卡盾藻共培养; 混合4 为三种藻共培养。混合处理中各藻种的初始细胞密度和混合比例见表1。不同混合组合分别在20℃和25℃温度下培养, 每个温度处理3组平行。每2d 进行细胞计数。虽然单种培养和混合培养的初始密度不同, 但所能达到的环境容量是一致的(王朝晖 等, 2010; 毕相东 等, 2016; 张达娟等, 2017), 因此单种培养的环境容量可与混合培养的进行比较。

表1 不同混合处理的初始密度和混合比例Tab. 1 Initial cell intensities and mixture ratios of various combination cultures

1.2.3 细胞生长

藻液使用鲁格氏碘液固定, 固定后的藻液在光学显微镜(奥林帕斯, CX23, 日本)下观察计数。其中抑食金球藻使用血球计数板, 中肋骨条藻和海洋卡盾藻使用浮游植物计数框。

1.2.4 叶绿素a 含量测定

10～20mL 藻液过滤至 GF/F 玻璃纤维滤膜(0.7μm, Whatman, 英国)上, 取滤膜至离心管内并添加5mL 预先4℃冰箱冷却的90%丙酮溶液。离心管由锡箔纸包裹做避光处理, 置于 4℃下提取24h。提取液使用0.22μm 滤膜过滤细胞残渣后, 吸取2mL 于比色皿中, 在紫外-可见光分光光度计(日立, 日本)下分别测定波长为 630、647、664 和750nm 的吸光度。叶绿素a 含量(Ca, 单位: μg mL-1)的计算公式为

式中D630、D647、D664 和D750 代表波长的吸光度, 数字表示波长值。

1.2.5 叶绿素荧光测定

2mL 藻液黑暗放置15min 后, 使用掌上水体叶绿素荧光仪AP-C 100(PSI, 捷克)测定最大光化学效率 Fv/Fm, 仪器设置饱和光强 3000μmol photons m-2·s-1, 测定数据由FluroPen 软件导出(Strasser et al,2001)。

1.2.6 数据处理与统计分析

在 Origin 2021 中使用 logistic 方程N ＝K/(1 + e(a-rt))对微藻种群增长进行非线性回归分析。式中N 表示种群密度; t 表示时间; ɑ 表示曲线原点的相对位置, 其值取决于N0。由此计算环境容量K 和內禀增长率r。根据公式Tp=a/r 计算曲线达到生长拐点的时间。

采用SPSS25.0 的One-way ANOVA 进行统计分析, P＜0.05 为差异显著。文中绘图采用Origin 2021绘制。

2 结果

2.1 单种培养

在20℃条件下, 中肋骨条藻的内禀增长率r 最高, 为0.45, 远高于抑食金球藻的0.24 和海洋卡盾藻的0.26(表2)。温度提高至25℃对于细胞增长的影响是显著的, 但影响不同微藻的方式存在差异(图1、表2)。25℃处理对细胞增长的正面效应主要体现在种群内禀增长率r 的提升和生长拐点时间Tp的提前。抑食金球藻和海洋卡盾藻的r 均被显著提升(P＜0.05), 中肋骨条藻的则无明显变化(表2)。此外, 25℃下三种微藻的生长拐点时间均被提前。然而, 抑食金球藻和中肋骨条藻的环境容纳量 K 在25℃下分别降低60%和14%, 并且生长曲线均呈现达到一定细胞密度先下降后回升的现象(图1)。25℃培养的抑食金球藻甚至在培养前期(0—4d)的细胞数量也存在下降的现象。这表明25℃已对中肋骨条藻和抑制金球藻产生热胁迫, 而其细胞密度回升为再适应过程。温度的变化对于海洋卡盾藻的K无明显影响。

在抑食金球藻和中肋骨条藻中, 单位细胞的叶绿素a 含量在培养初期对温度变化并不敏感, 在细胞量下降过程中出现升温对其含量的促进作用, 在细胞量回升过程中开始逐步降低并低于20℃的含量。而海洋卡盾藻在25℃下的叶绿素含量一直低于20℃。温度的上升在培养前中期对藻种的Fv/Fm起到促进或者无明显的影响, 只有在培养后期显著低于20℃(培养天数＞20d)。

表2 不同温度和混合处理下三种藻的生长参数Tab. 2 Parameters of growth for three algae species under various temperature and combination treatments

图1 抑食金球藻(a—c)、中肋骨条藻(d—f)和海洋卡盾藻(g—i)在不同温度下的细胞密度、叶绿素a 含量和最大光化学效率Fv/FmFig. 1 Cell densities, cellular contents of chlorophyll a, and maximum photochemical efficiency Fv/Fm for A.anophagefferens (a-c), S. costatum (d-f), and C. marina (g-i) under different temperatures

2.2 混合培养

当抑食金球藻和中肋骨条藻混合时, 即混合1,二者的生长拐点达到的时间都相较单种培养延长至2.5～3 倍(图2、表2)。中肋骨条藻在前期的快速增长, 分别在第12 天和第6 天在种群数量上超越抑食金球藻; 无论温度变化, 其r 值并未受到共培养的影响。随着中肋骨条藻的种群数量的上升, 20℃下抑食金球藻也出现了下降又回升的现象。这表明在竞争中, 中肋骨条藻对于抑食金球藻的生长存在抑制效果。抑食金球藻的环境容纳量相较于单种培养下降了近60% (20℃)～70% (25℃); 而20℃和25℃下中肋骨条藻的K 均上升了近40%。此外, 25℃单种培养下中肋骨条藻细胞数下降后回升的现象并未出现在共培养处理中。

图2 20℃和25℃下不同混合处理下抑食金球藻、中肋骨条藻和海洋卡盾藻的细胞密度Fig. 2 Cell densities of A. anophagefferens, S. costatum and C. marina under different combinations with 20℃ and 25℃

当中肋骨条藻和海洋卡盾藻混合时(混合2), 海洋卡盾藻的生长拐点时间约延长至1.7～2 倍, 而中肋骨条藻的约延长至2～2.25 倍。在两个温度处理下,中肋骨条藻的r 值均提升至0.52, 表明海洋卡盾藻的添加有助于中肋骨条藻的细胞增长。而中肋骨条藻的添加则显著抑制海洋卡盾藻的生长, 海洋卡盾藻的K 相较于单种培养下降了近64% (20℃)～80%(25℃)。中肋骨条藻的K 在20℃时上升了43%, 而在25℃时下降了约48%。这表明中肋骨条藻虽然能从海洋卡盾藻的添加中获得收益, 但仅限于20℃环境下。

当海洋卡盾藻与抑食金球藻混合时(混合3), 海洋卡盾藻的生长拐点时间约延长至4.2～6.3 倍; 抑食金球藻的延长至约1.6 倍。在20℃下, 抑食金球藻种群数量的增长导致海洋卡盾藻在第12—14 天期间细胞密度约降低16 倍, 并且在第24 天完全死亡。其K 值在相较于单种培养下降72%。在25℃时, 海洋卡盾藻则正常生长, 并且K 值增长120%。抑食金球藻在共培养处理中, K 值均被抑制, 20℃和25℃分别下降50%和70%。但在25℃培养前期, 生长被抑制期从单种培养的4d 缩短至2d, 这可能得益于海洋卡盾藻的添加。

在三种藻共培养体系中, 中肋骨条藻仍能保持高增长率, 分别在第10 天(20℃)和第8 天(25℃)在种群数量上超过抑食金球藻。在20℃下, 中肋骨条藻的K 达到最高值, 相比较单种培养的增长108%, 25℃下亦增加11%。而抑食金球藻的K 达到最低值, 仅为单种培养的21% (20℃)和28% (25℃)。海洋卡盾藻的K 在20℃下降60%, 在25℃下降48%。两两共培养结果显示抑食金球藻的生长均受到其他两种藻添加的抑制, 三种藻混合则进一步提升对抑食金球藻生长的抑制率。而在25℃下则会加剧抑食金球藻种群数量的下降。中肋骨条藻作为种间竞争的优势种, 在其更适应的20℃条件下可从抑食金球藻和海洋卡盾藻的添加中获取叠加收益。

3 讨论

3.1 温度对种间竞争的影响

三种微藻的最适温度存在差异。中肋骨条藻在20℃和25℃的内禀生长率无明显差异, 已有研究表明中肋骨条藻在20～25℃达到最大生长率(张磊 等,2020; 张小华 等, 2020)。但温度的升高限制其环境容量。抑食金球藻的最适温度为20℃, 这与中肋骨条藻的适宜温度重叠。海洋卡盾藻则更适应25℃。黄娟 等(2009)曾报道海洋卡盾藻在30℃条件下达到最大生长率。它的最适温度与其他两种藻产生错位。

微藻对温度的适应性影响种间的相互竞争。由于中肋骨条藻和抑食金球藻均对25℃敏感, 因此海洋卡盾藻在与它们在25℃共培养时, 相比20℃, 其所受的环境容量下降有所缓解甚至转变为促进。如在20℃时抑食金球藻可导致海洋卡盾藻死亡, 但在25℃下, 海洋卡盾藻可正常生长, 而抑食金球藻的环境容纳量抑制率从 20℃的 50%上升至 25℃的70%。此外, 由于抑食金球藻的最适温度与中肋骨条藻高度重合, 温度的改变并未影响中肋骨条藻对其环境容量的抑制率, 均保持在较高的60%～70%。

3.2 微藻种群竞争与策略

细胞接触、资源竞争和化感作用被认为是微藻种间竞争的重要因素(潘克厚 等, 2007)。抑食金球藻与多种其他赤潮肇事种竞争中均处于劣势地位,例如三角褐指藻对抑食金球藻的抑制率高达98%(张达娟 等, 2017), 小球藻的在95%～98%左右(毕相东 等, 2016)。三角褐指藻和小球藻的培养滤液添加实验结果表明, 抑食金球藻处于竞争劣势主要归因于添加藻分泌的化感物质能够有效抑制其生长(毕相东 等, 2016; 张达娟 等, 2017)。已有多篇研究报道了中肋骨条藻对其他藻种的化感效应(Matsubara et al, 2008; Nagasoe et al, 2010; Qiu et al, 2014)。亦有研究表明, 海洋卡盾藻能产生化感物质抑制其他浮游植物(Qiu et al, 2011; Fernández-Herrera et al, 2016)。虽然中肋骨条藻和海洋卡盾藻的添加可有效减少抑食金球藻的环境容纳量, 但是它们是否对抑食金球藻存在化感效应尚未可知。

此外, 三种微藻共培养结果表明, 无论促进还是抑制均观察到协同效应。中肋骨条藻可以在与其他两种藻竞争中获益, 其环境容量在三种微藻混合培养时达到最大, 为对照组的208%, 其收益率与混合1(139.7%)和混合2(143.1%)的乘积199.9%相近。抑食金球藻的环境容量在三种微藻共培养时缩减至最低值, 仅为对照组的 21.48%, 略微高于混合1(29.7%)和混合3(51.5%)的乘积15.3%。这些结果均指向抑食金球藻在更为复杂的浮游植物群落中难以获取优势地位。

自2009 年以来, 褐潮在我国的频发说明抑食金球藻在种群竞争策略上具有复杂性和独特性(雷蕾等, 2016)。无论温度或共培养处理的变化, 中肋骨条藻均保持较高的内禀增长率。中肋骨条藻在前期快速增长, 当达到最大细胞密度后, 迅速进入衰亡期,为典型的r-策略者。该结果符合对小型硅藻竞争策略的描述(吕颂辉 等, 2006)。对甲藻的研究报道显示, 如海洋卡盾藻、东海原甲藻、链状亚历山大藻等多属于k-策略者(刘望鹏 等, 2010)。其分裂速度较慢, 但对于营养盐的选择更为多样化, 可利用多种有机营养盐, 并且对于低营养盐具有较强的耐受能力。

抑食金球藻的内禀生长率介于中肋骨条藻和海洋卡盾藻之间(表2), 单独从内禀生长率难以判断抑食金球藻的竞争策略。本文实验选用的L1 培养基,所提供的氮源为硝酸盐, 而在尿素和硝酸盐混合营养条件下时, 抑食金球藻优先消耗尿素而非硝酸盐,说明抑食金球藻在营养盐选择上更偏好有机营养盐(Dong et al, 2014)。多种有机物如尿素、氨基酸、蛋白质、壳二糖和乙酰胺均能被抑食金球藻所利用(Mulholland et al, 2002)。现场海域的调查也显示, 抑食金球藻的爆发往往出现在有机物浓度高的海域(Glibert et al, 2007)。海湾中的海水长时间滞留无机营养盐消耗, 水体溶解有机物的累积更是为抑食金球藻提供适宜生长繁殖的营养盐环境(Wilson, 1995);而硝酸盐的添加促进非褐潮浮游植物群落的增长,抑食金球藻的相对丰度均显著下降(Gobler et al,2002)。但抑食金球藻对营养盐限制具有较强的耐受能力以及恢复能力。正面和反面的结果表明, 抑食金球藻在与非褐潮浮游植物的竞争之所以能够取得优势地位, 营养盐偏好的差异化是重要的影响因素,且更符合k-策略选择的特征。

抑食金球藻的爆发通常在温度较低的5、6 月份(15～20℃)爆发, 在温度超过25℃的7、8 月衰退(Nuzzi et al, 2004)。在藻华爆发密度较高的年份里,当海水温度重新降至20℃以下, 如秋、冬季, 褐潮将会再次出现(Gobler et al, 2002; Nuzzi et al, 2004)。共培养结果显示抑食金球藻在20℃下能与海洋卡盾藻竞争中取得优势, 但与中肋骨条藻竞争中处于劣势。这一结果从侧面解释了褐潮的出现通常在硅藻爆发之后。虽然抑食金球藻在无机氮营养环境下与硅藻竞争中处于劣势, 但硅藻或其他微藻爆发使得无机氮被大量消耗, 而其衰亡过程伴随着有机氮的增加, 有利于抑食金球藻的增长繁殖(LaRoche et al,1997; Glibert et al, 2007)。

4 结论

海洋卡盾藻和中肋骨条藻添加均可对抑食金球藻的生长造成不同程度的抑制, 而中肋骨条藻则在与其他两种藻混合中获益。微藻对温度的适应程度 影响微藻种间竞争。