马铃薯双单倍体诱导及辅助育种研究进展

白继鹏　王洪洋　李灿辉

摘 要：马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继水稻、小麦、玉米之后全球第四大粮食作物。然而生产上种植的马铃薯多为四倍体普通栽培种，且由于其复杂的四体遗传和高度杂合的基因组等因素，严重阻碍了马铃薯遗传育种和品种改良的进程。人工诱导方法尤其是孤雌生殖诱导产生马铃薯双单倍体是解决上述问题的有效途径。马铃薯双单倍体不仅有助于普通栽培种马铃薯遗传改良，而且还可以二体遗传模式进行农艺性状遗传解析。概述了马铃薯双单倍体的育种应用、诱导方法、影响因素、鉴定方法等方面的研究进展，同时探讨了马铃薯双单倍体诱导的研究方向。

关键词：马铃薯;孤雌生殖诱导;双单倍体，辅助育种

中图分类号：S532 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）04-001-07

Abstract： Potato （Solanum tuberosum L.） is the world's fourth largest food crop after rice， wheat and maize. However， most of common potato cultivars were tetraploid. And the progress on potato genetic breeding and variety improvement was severely retarded due to its complex tetraploid inheritance and highly heterozygous genome. Artificial induction， especially parthenogenesis， is an effective way to solve the above problems. Potato dihaploid is not only helpful to the genetic improvement of common cultivar potato， but also will be used for the genetic analysis of agronomic traits. Here， we review the research progress on potato dihaploid breeding application， induction method， influencing factors， identification method， and discussed the research direction of potato dihaploid induction.

Key words： Potato; Parthenogenesis induction; Dihaploid; Assistant breeding

马铃薯（Solanum tuberosum L.）为茄科（Solanaceac）茄属（Solanum）一年生草本植物，同水稻、玉米、小麦为世界四大粮食作物[1]。马铃薯因其抗逆性强、营养价值高、增产潜力巨大而广泛种植，被很多国家当作主粮食用[2-3]。据联合国粮食及农业组织（http：//www.fao.org/faostat/zh/#search/potato）数据显示，截止到2019年，中国马铃薯种植面积约为491.5万hm2，总产量为9188余万t，均居世界首位。2015年1月，中国启动马铃薯主粮化战略，旨在推动马铃薯消费趋势和食用方式的转变，从而促进国民消费主食多样化、营养多元化[4-5]。

生产上种植的马铃薯多为四倍体普通栽培种，由于其复杂的四倍体遗传和高度杂合的基因组等因素，严重阻碍了马铃薯遗传育种和品种改良的进程。同时又因为染色体倍性水平和胚乳平衡数不同造成的性障碍，导致四倍体栽培种与具有优良性状的二倍体野生种或原始栽培种间很难直接杂交或杂交后产生不育的三倍体等情况，从而无法直接利用其中的优良基因[6-7]。通過诱导或花药、花粉、子房等组织离体培养等方式获得双单倍体进行育种，可有效解决上述问题。同时通过技术手段对获得的具有优良性状的双单倍体进行染色体加倍处理，从而培育出满足人类生产需求的四倍体栽培品种[8]，这对马铃薯种质资源创新和品种改良具有极大的意义。笔者系统地阐述了马铃薯双单倍体的产生方法、影响因素和鉴定方法，总结了目前植物尤其是农作物领域诱导单倍体方法的一些研究进展，并展望了马铃薯双单倍体育种的发展趋势。

1 马铃薯双单倍体育种背景

1.1 双单倍体的定义

植物单倍体，是指具有胚子染色体数目的孢子体。像马铃薯普通栽培种这样的同源四倍体，产生的单倍体含有两组同源染色体，故称之为双单倍体（Dihaploid，2n =2x = 24）;二倍体野生种或原始栽培种，包括双单倍体产生的单倍体称之为单单倍体（Monohaploid，n = x = 12） [9-10]。

1.2 双单倍体育种的优势及相关研究进展

1.2.1 双单倍体育种的优势 利用单倍体进行作物育种有着极大优势，传统四倍体马铃薯杂交育种，因其遗传复杂性难以获得具备较多优良性状且能稳定遗传的品种，育种周期很长，而通过双单倍体育种，加之人工诱导染色体加倍处理，可以在相对短期内就获得纯合四倍体，在筛选优良性状上更加容易、高效，极大地提高了育种效率[11]。

马铃薯双单倍体与二倍体野生种相比，具有相同的染色体数目，遗传行为十分相似，便于遗传操作，可以直接与二倍体野生种杂交产生后代，弥补了四倍体与二倍体间杂交不亲和或产生不育三倍体的缺陷，从而能充分挖掘利用野生种中如抗逆、抗病虫害、高干物质含量等优良性状基因，得到性状优异的理想后代[12-13]。

通过对双单倍体进行人工诱导染色体加倍后可得到纯合四倍体，相互之间可以杂交，进而通过杂交后代实生种子繁殖，有效解决马铃薯传统栽培种植中繁殖系数低、贮运不便、易携带病害和高成本等诸多问题。

利用获得的马铃薯双单倍体品系，可以简化其遗传特征分析，结合分子标记、基因编辑、基因克隆等分子手段，能快速从基因层面对马铃薯的抗病虫害性、抗逆性、营养价值、欣赏价值等特征特性进行精准改造，实现分子设计育种。

1.2.2 马铃薯双单倍体相关研究与利用 20世纪80年代起，国内学者开始利用孤雌生殖诱导栽培种马铃薯，获得了一系列双单倍体材料，筛选出诱导率较高的母本材料和诱导系，为二倍体野生种优良基因向四倍体栽培种的成功导入及马铃薯种质资源创新奠定了基础[14-18]。中国农业科学院在80年代利用有性多倍化将二倍体野生种中抗病、淀粉含量高等优良基因转移到四倍体栽培种中，极大地丰富了育种材料并显著缩短了育种周期[19]。20世纪末期，戴朝曦等[20]利用双单倍体与南美二倍体栽培种、野生种杂交，结合染色体加倍技术，选育出具备高产、抗病、高淀粉含量等优良性状的甘农薯2号等四倍体栽培种优良品系;同时他们也通过双单倍体花药培养、两次染色体加倍等技术手段获得纯合四倍体品系进而获得不分离的马铃薯实生种子，以解决传统马铃薯栽培中存在的种薯贮运不便、成本高等问题。近年来，赵明辉等[21]利用二倍体马铃薯材料的丰富遗传变异性，在马铃薯耐盐育种方面取得了重要进展，若进一步将双单倍体材料与这些耐盐品种杂交，可为选育出具有耐盐优良性状的四倍体栽培种提供更多可能性。Jari等[22]通過花药培养从四倍体栽培种马铃薯Pito中获得了9个矮秆马铃薯双单倍体品系，进一步实验确定了马铃薯矮秆由隐性基因pito所引起，并测定了赤霉素（GA）含量。由于赤霉素在马铃薯发芽和茎的伸长中起着重要作用，因此该项建立在双单倍体水平上的研究为马铃薯重要生理指标的基因定位及分子设计育种奠定了一定基础。在Manrique-Carpintero等[23]的研究中，通过构建一个雌核发育的双单倍体群体来了解栽培种马铃薯的遗传景观，试验结果表明与四倍体马铃薯遗传负荷相关的潜在有害突变可以被多个基因位点缓解。

马铃薯双单倍体除辅助普通栽培种马铃薯遗传改良外，还可采用二体遗传模式进行抗病基因遗传分析。EI-Kharbotly 等[24]利用孤雌生殖诱导获得的含抗晚疫病基因Rpi-R1和Rpi-R3的双单倍体材料，通过构建抗、感分离群体并结合RFLP 分子标记，成功将Rpi-R1定位在 5号染色体上，Rpi-R3定位在11号染色体末端。Bradshaw等[25]以孤雌生殖诱导获得的马铃薯双单倍体PDH247为母本（抗病）、Solanum phureja材料DB226（70）为父本（感病）构建回交群体，结合发病表型、AFLP 和 SSR 标记对该群体120个子代及亲本进行分析，最后在4号染色体上定位到一个抗晚疫病 QTL。Velásquez等[26]对利用孤雌生殖诱导获得的149个马铃薯双单倍体株系进行卷叶病毒抗病鉴定，通过对抗感病植物的分析在5号染色体上臂成功定位到一个抗卷叶病毒基因Rladg。Bartkiewicz等[27]通过孤雌生殖诱导四倍体马铃薯Karolin（抗癌肿病）获得 215个双单倍体株系，并对其进行癌肿病抗病鉴定，结合12.8 k SolCAP马铃薯SNP芯片和集群分离分析法对双单倍体群体进行遗传分析，定位到一个抗病区间Xla-TNL，最终通过开发和加密分子标记将抗癌肿病基因定位区间缩小至800 kbp。

综上所述，利用双单倍体尤其是孤雌生殖诱导产生双单倍体在马铃薯品种改良、遗传解析、重要基因定位等方面具有重要意义和巨大潜力。

2 马铃薯双单倍体诱导产生的方法

在无人工干预的情况下植物自发形成单倍体的概率极低（0.002%～0.02%），远远无法满足生产中的育种需求，因此需要采用人工诱导的方式来获得单倍体[28]。目前人工诱导马铃薯双单倍体的方法主要包括两大类共四种：一是孤雌生殖诱导系诱导的孤雌生殖;二是植物单倍体组织离体培养，包括花药培养、花粉培养和子房培养。

2.1 孤雌生殖诱导法

孤雌生殖，也称为单性生殖，即雌配子体不经过受精，在基因控制或其他外界刺激下而引起分裂直接发育成胚[29]。自然条件下植物发生孤雌生殖概率极低。孤雌生殖诱导是产生马铃薯双单倍体的主要方式[30]，该法以基础四倍体材料为母本、二倍体诱导系为父本，在四倍体材料生长到一定时期后对花蕾去雄，用诱导系花粉进行授粉，精子不使卵细胞受精，但刺激卵细胞分裂并发育，得到双单倍体实生种子。

早在20世纪50年代，Hougas 和Peloquin [31]首次从四倍体品种 Katahdin与S. phureja 的杂交后代中得到了一株双单倍体。双单倍体的形成与四倍体受体和二倍体诱导系之间的相互作用有极大的关系，所以此后筛选优良的受体亲本和授粉者就成为了孤雌生殖诱导产生马铃薯双单倍体的关键[32]。目前已经得到的应用于马铃薯双单倍体研究的一些优良授粉者包括P1225682.22、IVP35、IVP48、IVP101等[33-36]。目前来看，孤雌生殖诱导率仍较低，如何从大量的诱导杂交后代中鉴定挑选出双单倍体也是一个亟需解决的问题[37]。

2.2 花药培养法

花药培养，也称雄核发育，是获得单倍体的重要方法之一，其基本过程就是通过花药接种并诱导形成愈伤组织，最后发育成一株完整植株 [1]。

1973年Dunwell和Sunderland[38]首次利用马铃薯品种Pentland Crow进行花药离体培养，获得马铃薯再生植株。在我国马铃薯花药培养的研究可追溯到20世纪80年代戴朝曦[39]通过四倍体马铃薯花药培养获得愈伤组织分化形成61株苗，但未进行倍性检测。诱导率和成苗率较低是目前在马铃薯花药培养中存在的主要问题。2014年贺苗苗[40]利用20个马铃薯品种花药进行培养，结果显示不同品种的花药在愈伤组织诱导率方面有着较为显著的区别，存在基因依赖性，这与刘辉[41]的研究结果一致。赵欣[42]的研究指出，通过调整培养基中NAA和2，4-D等浓度配比、蔗糖浓度等成分，以及加入适宜浓度的硝酸银、活性炭和马铃薯提取液，可以提高愈伤组织诱导率。

2.3 花粉培养法

花粉培养，也称游离小孢子培养，其基本过程和花药培养十分类似，是将花药中的花粉分离培养，最终分化形成完整植株。20世纪60年代Guha等[43]就通过人工方式诱导曼陀罗产生了胚状体并推测这些胚状体起源于花粉或花药。1988年报道了中国首例花药离体培养获得双单倍体的試验，高秀云[44]利用接种花粉中取得的小孢子进行培养，得到了3株双单倍体。1990年左秋仙等[45]发现在分离马铃薯花粉前对花药进行预培养，可以显著提升其产生愈伤组织的概率。2009年吴旺泽等[46]的研究表明，利用花粉培养获得愈伤组织存在一定的基因依赖性。唐飞等[47]对二倍体马铃薯品种E172花粉萌发的具体条件作了研究分析，试验结论与吴旺泽等[46]的相符。

2.4 子房培养法

子房培养，主要是对未受精的子房而言，是将其置于诱导培养基中培养获得完整的植株。1964年，Tulecke[48]利用裸子植物银杏的未受精子房进行培养并得到单倍体植物愈伤组织。对于马铃薯，在1985年，陶自荣等[49]就报道了首例利用马铃薯未传粉子房进行离体培养获得植株的研究，经检测所获植株为双单倍体。相比花药培养，未受精子房更加容易形成愈伤组织 [1]。影响子房培养产生双单倍体的因素包括子房的诱导分化能力和子房培养条件[50]。

3 影响马铃薯双单倍体产生的因素

在产生马铃薯双单倍体的几种方法中，孤雌生殖诱导是目前研究最多、最有效的方法，因此以下主要对该法进行论述。

3.1 母本材料影响马铃薯双单倍体的产生

在进行马铃薯孤雌生殖诱导时，选择合适的母本材料可以提高诱导产生双单倍体的概率。庞万福等[14]利用中薯2号、79-6-19和800935等3个四倍体母本材料与11个授粉者杂交，发现中薯2号的诱导率显著高于其他两个母本材料，说明母性效应在马铃薯双单倍体诱导中起着十分重要的作用。李先平等[17]用13个四倍体栽培种与9个授粉父本材料进行杂交，通过统计结实率、双单倍体诱导率等数据，结果也显示不同的母本材料诱导率差异十分明显。

3.2 父本材料影响马铃薯双单倍体的产生

选择优良的父本材料作为授粉者对植物孤雌生殖诱导产生单倍体来说也极为重要。胡尔良[51]和张强[52]研究玉米孤雌生殖诱导产生单倍体的结果表明，不同诱导系之间的单倍体诱导率差异极为显著。同样在马铃薯中，二倍体授粉者主要通过对胚乳的作用进而影响双单倍体的形成[53]。庞万福等[14]利用11个父本材料进行了授粉实验，结果显示S. phureja后代中93002-1-4的诱导率达到了81.8%，而93002-4-4的诱导率仅有14.6%，作为对照的IVP35和IVP48诱导率仅为3.8%和4.0%。李先平等[17]通过实验筛选出了两个优良的二倍体父本授粉者，并通过对实验数据的分析证明了授粉者的结实率与其诱导产生双单倍体的诱导率之间并无关联。Hermsen和Verdenius[36]通过研究认为优良的授粉者应该具备以下特征：（1）花粉育性高，这能保证马铃薯的杂交结实;（2）胚斑标记基因纯合，有利于从杂交产生的大量种子中筛选出双单倍体种子以及后续植株，提高双单倍体的选择效率;（3）具有较高的双单倍体诱导率。

3.3 母本、父本之间的互作对马铃薯双单倍体产生的影响

Frandsen等[54]的试验表明，相同的父本诱导系材料诱导不同的母本材料时，其诱导率不同，Hermsen等[55]的研究显示，相同的母本材料接受不同的父本诱导系花粉所产生双单倍体概率也不同。这些研究表明，母本材料和父本诱导系授粉者之间存在一定互作进而影响双单倍体的产生。

3.4 环境因素影响马铃薯双单倍体的产生

除了以上马铃薯本身的3个因素外，环境因素，如气候、温度等对双单倍体的产生也有一定的影响。Liu等[56]分别在1989年秋、1990年春和1990秋对8个品种进行孤雌生殖诱导，结果表明不同年份的同一季节、同一年份的不同季节之间气候的差异，对诱导率产生了影响。同时，给母本材料授粉时的温度、湿度也会对诱导率产生影响[53]。据金黎平等[57]的研究，昼温21～24 ℃、夜温13～16 ℃、湿度80%左右时进行授粉诱导率最高。吕文河等[18]对室内花枝水培技术进行研究，结果表明该技术可以提高马铃薯植株坐果率，进而提高诱导效果。

4 马铃薯双单倍体的鉴定方法

4.1 形态学鉴定

细胞内染色体倍性降低，会使植物细胞和植株的各器官相应减小，所以可根据马铃薯植株形态及茎、叶、花等器官在各倍性之间的差异来进行倍性鉴定。一般来说，双单倍体植株较四倍体植株长势普遍较弱、叶片较小、所结薯块较小。利用形态学鉴定方法判断马铃薯二倍体植株是最简单直观的方式，但受种薯质量、种植环境、病虫害、个人主观经验意识等影响较大，且马铃薯各品种的长势相对不一致，因此也存在一定的判断难度。

4.2 流式细胞仪鉴定

流式细胞仪，或称倍性分析仪，可以定量测定细胞中DNA、RNA等分子的质量。随着细胞倍性的增加，各指标也会呈倍性增加，故可用该仪器来进行马铃薯植株倍性的鉴定。通过该法进行倍性鉴定，一般几分钟就可得到结果，快速、简便，准确率高，缺点是仪器较为昂贵，实验室装备率低。

4.3 花粉粒大小鉴定

四倍体栽培种马铃薯所产生的花粉粒中含有两组同源染色体，双单倍体马铃薯产生的花粉粒中仅含有一组染色体，前者比后者多了一倍的染色体，原生质也相对比较丰富，故四倍体植株花粉粒比双单倍体植株花粉粒体积更大，通过对花粉粒的镜检可以对其倍性进行鉴定。

4.4 全基因组单核苷酸多态性（SNPs）基因分型鉴定

2018年Ellis等[58]使用了SNP基因分型方法对国际马铃薯中心基因库的倍性水平进行分类，确认材料的遗传同一性并评价马铃薯种质的遗传多样性。2019年Alsahlany等[59]使用SNP基因分型来鉴定马铃薯倍性，结果表明，SNP基因分型鉴定、流式细胞仪鉴定和下文要介绍的叶绿体计数方法对其所鉴定的材料来说效果是一致的。

4.5 保卫细胞大小、保卫细胞中叶绿体数目及单位面积气孔数鉴定

植物的叶片中保卫细胞大小、气孔大小、保卫细胞中叶绿体数目和单位面积气孔数与染色体倍性有关[60]，所以可通过检测比较不同倍性马铃薯品种之间上述指标的差异进行倍性鉴定。Ellis等 [58]试验表明，通过叶绿体计數是区分二倍体、四倍体马铃薯的一种有效而廉价的方式。

4.6 胚斑标记鉴定

诱导系中一般含有显性纯合胚斑标记基因（BB），后代杂种四倍体或三倍体种子的胚基部会呈现深紫色，无胚斑标记的种子为双单倍体，故可据此筛选出双单倍体种子。但遗传背景不同和剂量效应也给胚斑标记的识别带来一定难度[61] ，因此仅可用来剔除一部分杂种。此外诱导系的紫色胚轴标记基因会使后代植物上胚轴等部位产生紫色色素积累，也可据此剔除一部分杂株[14]。

4.7 细胞染色体压片观察法鉴定

细胞染色体压片观察法，直接通过显微镜对细胞染色体观察计数，对于倍性鉴定来说最为准确。该法通常是取马铃薯匍匐茎尖或根尖材料进行预处理、固定、解离、染色，最后进行镜检计数。但该法实际操作起来对实验人员技术要求较高，制片过程容易受到多种因素影响，要想获得一张能够对染色体进行清晰准确计数的压片，需要对试验流程进行大量摸索。

5 其他植物单倍体诱导研究进展及启示

在孤雌生殖诱导产生单倍体的过程中，父本诱导系的选择是单倍体保证诱导率的关键。董昕[62]在对玉米的单倍体诱导QTL qhir1中作了精细定位，明确指出诱导系是否携带该基因是诱导率高低的关键;同时通过该基因开发了相应的分子辅助标记，从而实现对玉米单倍体诱导系的高效选育。2019年ZHONG等[63]克隆了玉米单倍体诱导中的另一个关键QTL qhir8，并指出突变qhir8中的ZmDMP基因能够增强玉米单倍体的诱导率。马铃薯由于其同源四倍体的遗传复杂性，要实现类似诱导基因的定位存在一定难度，但也可通过目前已获得的孤雌生殖诱导双单倍体材料进行探索。

陈琦[64]的研究表明，单倍体玉米愈伤组织细胞壁厚度大于二倍体，这可对马铃薯进行探索，从而开拓其新的双单倍体鉴定方式。

目前已有诸多植物孤雌生殖诱导机制方面的研究。山东大学GAO等[65]以棉花为试验对象，采用RNA干扰技术和体外喷施抑制剂CYC的方法来模拟诱导产生单倍体的过程。该研究表明，无论是通过RNA干扰技术或是用化学抑制剂在体外抑制组蛋白CenH3的表达，都可产生大量有缺陷的空核小孢子，这种假雄配子可通过与正常雌配子结合，以模拟有性生殖的形式产生植物单倍体。在此之前Amundson等[66]对167个双单倍体马铃薯基因组进行分析，结果表明孤雌生殖诱导产生的大多数双单倍体不存在诱导系DNA。

随着基因编辑技术CRISPR在植物领域的广泛应用，越来越多的作物可以通过该技术来产生单倍体，如董乐[67]通过该技术对玉米ZmMTL/ZmPLA1基因的定点敲除，获得了具备较高效率的单倍体诱导系，从而提高了玉米单倍体诱导效率。2020年LIU等[68]报道了通过基因编辑CRISPR技术敲除小麦体内与玉米MTL/ZmPLAT/NLD基因同源的TaPLA基因，诱导其产生单倍体，并分析了可以提高诱导率的一些方法。该项研究表明在多倍体中通过基因编辑的手段来实现植物的单倍体诱导是可行的，且由于基因序列和功能的保守性，该法也可以推广到如马铃薯等其他作物上。但在该报道中，小麦的单倍体诱导率为5.88%～15.66%，与传统的诱导方式相比，诱导率提升并不显著。组蛋白CenH3在真核细胞着丝粒上起着较为重要的作用，使用包括CRISPR技术、EMS诱导等方式对其进行修饰、编辑也能诱导产生单倍体，同时改变CenH3的2个氨基酸组合可以提高单倍体诱导率[69-70]。

6 总结与展望

随着马铃薯主粮化的推广，未来市场对马铃薯的需求逐渐扩大，马铃薯的种植面积将再创新高。然而如何根据市场需求和种植条件选育理想的马铃薯品种，仍是一个亟待解决的问题。传统的马铃薯栽培种为同源四倍体，存在着很多不足，而通过一些技术手段获得马铃薯双单倍体，无论是对种质资源创新、提高育种效率，还是对解析马铃薯遗传规律，都是极有价值的。

对马铃薯孤雌生殖诱导分子机制的探究是马铃薯双单倍体育种的关键。在获取马铃薯双单倍体的方法中，孤雌生殖诱导是目前来看最具潜力的诱导方式，但因其诱导分子机制尚不明确，所以该方式往往存在随机性和盲目性，加之其低诱导率、难以从大量诱导出的杂种中快速准确地对双单倍体进行有效鉴定，因此严重阻碍该法在育种上的有效应用。目前其他植物如棉花也有对其孤雌生殖诱导机制研究的报道，这对探究马铃薯孤雌生殖诱导机制有一定的借鉴作用。

同时，也不能忽略其他方法。CRISPR等技术打破了细胞壁的壁垒，将基因编辑手段应用于植物细胞，并在小麦等多倍体作物上得以成功诱导单倍体产生，这为同源四倍体的马铃薯单倍体诱导指明了一个新的研究方向。但目前CRISPR基因编辑诱导率仍有待提高。如何找到诱导单倍体产生的关键基因、不断摸索提高诱导率的方法、探究最适宜的诱导条件以产生更多能用于农业育种的双单倍体应该是下一步的研究重点。如何高效获得马铃薯双单倍体，是缩短马铃薯育种周期、提高效率、创新种质资源，以及辅助解析四倍体栽培种马铃薯优良性状调控机制的又一发展方向。

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