不同接种浓度绿球藻对水产养殖废水净化的影响

吕俊平 折雨亭 刘 洋 刘旭东 冯 佳 谢树莲

(山西大学生命科学学院, 太原 030006)

作为农业生产的重要组成部分, 水产养殖业为世界各地人口提供了重要的食物来源。饵料投放是水产养殖最为基础且关键的一个环节。然而, 饵料中只有大约9%和17%的氮磷被鱼类吸收[1], 其余未被吸收的部分进入水体。此外, 鱼类的排泄物也富含氮磷。因此, 在水产养殖过程中饵料的投放及鱼类排泄均会向养殖水体输入大量氮磷, 对水体造成严重污染[2,3]。

对于水产养殖废水的处理, 传统方法包括物理法和化学法。其中, 物理法对水产养殖废水中悬浮颗粒物质(例如, 残饵和鱼类排泄物)有较佳的去除效果, 但是难以去除氮磷等溶解性污染物[4]。化学法具有较好的处理效果, 然而由于处理成本高且易对水质造成危害, 因此在水产养殖中难以大规模推广应用[5]。

作为水生态系统中重要的初级生产者, 藻类在水环境治理方面发挥着重要作用[6]。运用微藻处理废水, 一方面可以净化废水, 另一方面可获得高附加值产品[6,7]。藻类能够高效地去除废水中氮磷等污染物, 同时处理工艺的建设和运行成本较低、维护简单, 因而受到国内外学者的广泛关注[8]。张继平等[9]发现小球藻能显著降低南美白对虾养殖废水中亚硝氮的含量。王荣霞等[10]研究了羽毛藻对石斑鱼养殖废水中氮和磷的吸收特性。显然, 藻类处理水产养殖废水是可行的。然而, 已有的报道更多的关注光照强度、光质和碳氮比等因子对微藻处理污水效果的影响。相比较而言, 起始接种浓度对微藻处理污水效果的影响较少被关注。

绿藻门的藻种是污水处理优质藻种的重要来源之一[11]。本课题组前期筛选获得一株绿球藻(Chlorococcum sphacosumGD)被证实可用于市政污水和牛场污水等的处理[12]。然而, 该藻株对水产养殖废水净化效果如何还不清楚。因此, 本研究以该藻株为材料, 通过设置藻液的起始接种浓度, 测定藻体生长状况和水产养殖废水中污染物的降解情况, 为选取适宜的接种浓度和评价微藻处理水产养殖废水的能力提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

藻种来源本研究所用藻种为绿球藻(Chlorococcum sphacosumGD), 从山西省关帝山八水沟风景区落叶松林下的苔藓中分离纯化获得[13]。BG11培养基用于该藻种的扩大培养。

水产养殖废水水产养殖废水取自山西省太原市鱼种场。为了去除废水中较大的悬浮颗粒物, 降低其对微藻培养的影响, 在使用之前将废水静置1h后取上清使用。

1.2 实验方法

藻种预培养绿球藻接种至装有BG11培养基的250 mL锥形瓶中, 然后置于光照培养箱中预培养。培养条件为: 光照强度3000 lx, 光暗比12h∶12h,温度25℃, 静置培养, 每天早中晚手动各摇动1次,使藻细胞呈均匀悬浮状态, 至对数生长期时进行后续实验。

藻种接种及培养取处于对数生长期的绿球藻培养液离心后(5000 r/min, 5min)接种至含有500 mL水产养殖废水的锥形瓶中, 设置6个接种浓度梯度: 0、25、50、100、200和400 mg/L。其中,0为对照组, 25—400 mg/L为实验组, 每个浓度梯度设置3个平行组。然后, 将锥形瓶至于摇床上培养。培养条件为: 光照强度3000 lx, 光暗比12h∶12h,温度25℃, 摇床转速150 r/min。在培养周期内, 每天取样用于相关指标的测试分析。

微藻生物质浓度测定采用干重法测定微藻生物质浓度[14]。利用公式(1)和(2)分别计算微藻的比生长速率和倍增时间:

式中,T为培养时间(d),NT2、NT1为第T2天和T1天的微藻生物质浓度(mg/L),μ为微藻的比生长速率(/d),Td为倍增时间(d)。

水质参数的测定采用纳氏试剂光度法(GB 7479-87)测定氨氮含量, 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-87)测定亚硝氮含量, 采用紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)测定硝氮含量, 采用钼锑抗分光光度法(GB 11893-89)测定磷含量, 采用重铬酸盐法(GB 11914-89)测定COD。

叶绿素含量和叶绿素荧光参数测定参照Mera等[15]的方法测定叶绿素含量。藻液离心(4500 r/min, 15min)后弃清液, 于沉淀中加入95%乙醇并混匀。然后, 将样品于黑暗条件下4℃放置24h, 然后离心获得上清液(8000 r/min, 10min)。于649和665 nm波长下, 采用紫外可见光分光光度计(TU-1810 DAPC,北京普析通用仪器有限责任公司, 中国)测定上清液的吸光度值, 用95%乙醇溶液作为空白对照。利用公式(3)和(4)分别计算叶绿素a和叶绿素b含量:

参照Markou等[16]的方法测定叶绿素荧光参数。取藻液3 mL于黑暗条件下处理30min, 然后于避光条件下采用手持式叶绿素荧光测量仪(捷克,AquaPen-C AC100)获取Fv/Fm和Fv/Fo值。

数据处理测量值采用平均值±标准误表示(n=3)。在0.05的置信水平下, 采用SPSS 19.0进行单因素方差分析, 比较各处理组间生长指标的差异。采用SPSS 19.0中的相关性分析模块来研究不同初始接种浓度与生长指标间的关系, 同时建立相应的回归方程,P＜0.05时呈显著相关。利用Origin 8.5做图。

2 结果

2.1 不同起始接种浓度下绿球藻的生长特性

如图 1所示, 绿球藻的生长未出现迟滞, 表明不同接种浓度下该藻株均能适应水产养殖废水。经过5d的培养, 绿球藻各实验组的生物质浓度分别增加至135、180、255、320和500 mg/L, 分别较初始接种时增加了1.42、1.5、1.5、1.19和1.06倍。相比于高起始接种浓度(200—400 mg/L), 较低起始接种浓度(25—100 mg/L)下绿球藻在水产养殖废水中生物量积累速度较快。此外, 我们分析了该藻株的生长速率和倍增时间(表 1)。当起始接种浓度由25 mg/L增加至100 mg/L时, 绿球藻的比生长速率由0.087/d增加至0.1/d, 倍增时间由7.89d下降至6.84d。继续增加接种浓度至400 mg/L后, 绿球藻的比生长速率降低至0.015/d, 倍增时间上升至44.8d。回归分析结果显示, 微藻的初始接种浓度与比生长速率呈显著负相关(r=−0.927,P＜0.05, 图 2a), 与倍增时间均呈极显著正相关(r=0.965,P＜0.01, 图 2b),说明随着初始接种浓度的增加, 比生长速率降低,倍增时逐渐增加, 较低的起始接种浓度有利于绿球藻的生长。

图 1 不同起始接种浓度下绿球藻的生长特征Fig. 1 The biomass concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 1 不同起始接种浓度下绿球藻的比生长速率和倍增时间(平均值±标准误, n=3)Tab. 1 The specific growth rate and doubling time of C.sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater (Mean±SEM, n=3)

2.2 不同起始接种浓度下绿球藻的污染物降解特性

在本研究中, 用于处理的鱼种场来源污水中COD、氨氮、亚硝氮、硝氮和总磷浓度分别的32.4、6.25、24.65、0.35和1.83 mg/L。将不同浓度绿球藻接种于污水后, 经过3d培养, 污染物浓度均大幅度降低(图 3)。其中, 接种浓度为100 mg/L时,污染物去除效率最高, COD、氨氮、亚硝氮、硝氮和总磷的去除率分别为88.89%、94.08%、97.44%、82.86%和 91.8%。在培养结束后(第5天), 不同接种浓度下的绿球藻对COD的去除率为87.69%—96.92%,氨氮的去除率为65.6%—98.08%, 亚硝氮的去除率为59.28%—98.67%, 硝氮的去除率为57.14%—91.42%, 总磷的去除率为78.14%—98.36%(表 2)。尽管不同接种浓度下污染物浓度均呈下降趋势, 但是污染物最终去除效率对起始接种浓度呈现出不同的响应。起始接种浓度为100 mg/L时, 绿球藻对水产养殖废水中COD、氨氮、亚硝氮、硝氮和总磷的去除效果要显著优于其他接种浓度下绿球藻的去除效果(P＜0.05, 表 2)。

2.3 不同起始接种浓度对绿球藻的叶绿素含量及叶绿素荧光特征的影响

如图 4所示, 在培养周期结束后, 绿球藻的叶绿素a浓度分别从0.48、0.98、1.98、3.75和6.28 mg/L增加至1.13、2.31、2.63、4.2和7.59 mg/L。叶绿素b浓度在培养结束时上升至0.26、0.7、0.88、1.59和3.17 mg/L。显然, 绿球藻细胞叶绿素含量随着接种浓度的增加而逐渐升高。

此外, 我们也分析了这叶绿素荧光参数对起始接种生物质浓度的响应。如图 5所示, 在所有接种浓度下, 绿球藻的叶绿素荧光活性较好。经过5d的培养, 绿球藻各实验组的Fv/Fm值维持在0.53—0.78,较初始接种时轻微的增长。而且, 在本研究的接种浓度范围内, 高接种浓度下绿球藻的叶绿素荧光活性较好。Fv/Fo的变化趋势类似于Fv/Fm。

图 2 绿球藻的接种浓度与生长特性的相关分析Fig. 2 The regression analysis between initial inoculation concentration and growth characteristics of C. sphacosum GD

3 讨论

通过培养微藻的方式处理废水是水产养殖废水处理的一种可供选择的方案。前人的一些研究工作发现微藻处理养殖废水时展现出了优秀的性能[17,18]。在本研究中, 不论绿球藻的起始接种浓度如何变化, 绿球藻的生长均未出现迟滞, 表明该藻株能够适应水产养殖废水, 具有良好的生长状况。尽管如此, 当起始接种浓度为25—100 mg/L时, 绿球藻的比生长速率为0.087—0.1/d。然而, 起始接种浓度上升至400 mg/L后, 比生长速率降低至0.015/d。Guerrero-Cabrera等[19]的研究发现, 小球藻、栅藻和单针藻在罗非鱼养殖废水中的比生长速率为0.006—0.018/d, 其低于本研究中低接种浓度下绿球藻的比生长速率, 但是和高接种浓度下绿球藻的比生长速率处于同一水平。王伟伟等[20]的研究发现, 湛江等边金藻在水产养殖废水中的比生长速率达到0.235/d, 其显著高于本研究中所有接种浓度下绿球藻的比生长速率。上述这些差异可能源自于藻种及培养条件等的不同[19,20]。更为重要的是, 我们的研究结果表明, 起始接种浓度影响了绿球藻的生长。Pelizer等[21]研究发现, 以低接种浓度(50 mg/L)培养螺旋藻时其生长速度最快。Nasir等[22]的研究表明, 相较于40%、50%和60%的起始接种浓度, 以10%、20%和30%的起始接种量培养的小球藻具有更高的生长潜力。显然, 本实验的研究结果与前人的研究结果基本一致。由于本研究采用批次模式培养绿球藻, 因此在一个培养周期内废水中的营养物是有限的。当微藻起始接种浓度超过一定的阈值后, 由于藻浓度过高导致藻细胞之间潜在的营养竞争加剧, 这可能是高接种浓度抑制微藻异养生长的一个重要原因[23]。为了使绿球藻在养殖废水中达到一个较好的生长状态, 在本研究的培养条件下,建议以低起始接种浓度(100 mg/L)接种绿球藻用于该藻株的培养。

图 3 不同接种浓度下绿球藻去除污染物的特征Fig. 3 Pollutants removal of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 2 不同接种浓度对绿球藻去除污染物效率的影响(平均值±标准误, n=3)Tab. 2 The performance on pollutants removal efficiency of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations(Mean±SEM, n=3)

图 4 不同起始接种浓度下绿球藻的叶绿素含量Fig. 4 Chlorophyll concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

图 5 不同起始接种浓度下绿球藻的叶绿素荧光特征测定Fig. 5 Chlorophyll fluorescence characteristics of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

微藻处理水产养殖污水的效率是本研究的一个重要关注点。有关微藻处理水产养殖废水的相关研究已有报道。陈春云等[24]的研究结果显示, 小球藻能够去除对虾养殖废水中80%的氨氮和85%的磷。栗越妍等[25]选用蛋白核小球藻、斜生栅藻、月牙藻和螺旋鱼腥藻处理罗非鱼养殖废水。这些藻种能够去除废水中30.2%—60.9%的氮和22.7%—76.1%的磷。许云等[26]选用双眉藻和等鞭金藻处理幼虾养殖废水, 其对废水中总磷的去除率为30.9%和70.9%, 对硝氮的去除率为72%和85.7%。马红芳等[27]的报道称, 栅藻能够去除养鱼场换排废水中85.8%的硝氮、96.3%的亚硝氮、95.5%的氨氮和98.8%的磷。在本研究培养结束后, 不同接种浓度下的绿球藻对 COD的去除率为87.69%—96.92%,氨氮的去除率为65.6%—98.08%, 亚硝氮的去除率为59.28%—98.67%, 硝氮的去除率为57.14%—91.42%, 总磷的去除率为78.14%—98.36%。很明显, 绿球藻处理水产养殖废水的效率持平甚至优于前人报道中相关藻种处理水产养殖废水的效率, 表明本研究所选用的藻种可以作为一个具有潜力的藻种可用于水产养殖废水的处理。此外, 本研究发现起始接种浓度为100 mg/L时, 绿球藻对水产养殖废水中污染物的去除效果要优于其他接种浓度下绿球藻的处理效果。考虑到该接种浓度下绿球藻生长良好, 大量污染物被该藻种同化后用于生物质的积累。一般而言, 由于微藻生长速度缓慢, 需要保持较长的水力停留时间(大于10d)以降解养殖废水中的大部分污染物[18,28]。在本研究中, 通过控制接种初始浓度, 在提高污染物去除率的同时缩短培养周期并提高了容积负荷, 这对于今后微藻用于大规模水产养殖废水的处理是有益的。在本研究中,当绿球藻接种浓度为25—50 mg/L时, 该藻株的生长速率与100 mg/L接种浓度下该藻株的生长速率基本一致。尽管如此, 过低的接种浓度使得参与污水处理过程的藻细胞基数低, 从而使其去除污染物的效率低于100 mg/L接种浓度下该藻株去除污染物的效率。基于上述讨论, 为了使绿球藻高效去除污染物, 在本研究的培养条件下, 建议以低起始接种浓度(100 mg/L)接种绿球藻用于水产养殖废水的处理。

在微藻处理废水过程中, 叶绿素含量和荧光参数特征能在一定程度上反映微藻细胞的生理活性状况[29]。在本研究中, 在不同起始接种浓度下, 培养周期结束后, 绿球藻的叶绿素含量均显著增长,而且叶绿素荧光参数值也保持在较高的水平。Fv/Fo与Fv/Fm分别反映了光系统 Ⅱ的潜在活性和原初光能转化效率[30]。因此, 在绿球藻处理水产养殖废水的过程中, 藻细胞具有良好的生理活性, 这也从一个侧面证明了该藻种可用于水产养殖废水的处理。

4 结论

微藻起始接种生物质浓度是影响绿球藻生长及水产养殖废水处理效率的一个重要因子。在本研究的培养条件下, 随着绿球藻初始接种浓度的上升, 其生长能力及污染物去除效率均有所降低。以低起始接种浓度(100 mg/L)接种绿球藻至水产养殖废水中, 在5d的培养周期内, 其能够高效去除废水中的COD、氨氮、亚硝氮、硝氮及总磷等污染物。控制微藻接种浓度在提高污染物去除率的同时缩短培养周期并提高了容积负荷, 这对于今后微藻用于大规模水产养殖废水的处理非常有益。