兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测

邢露梅 肖 伟, 李兰兰 张利平 赛清云, 俞兆曦, 吴旭东 * 连总强 *

(1. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070; 2. 宁夏回族自治区水产研究所(有限公司), 银川 750001;3. 宁夏渔业工程技术研究中心, 银川 750001; 4. 宁夏渔业科技院士工作站, 银川 750001)

兰州鲇(Silurus lanzhouensisChen)俗称黄河鲶[1],是黄河中上游特有的重点保护经济鱼类, 具有刺少、肉多和味美的特点, 富含多种人类必需氨基酸,俗有“黄河鲶鱼活人参”之美称, 2014年被评为“黄河生物名片”, 具有重要的生态功能和广阔的养殖前景[2,3]。近年来由于水利工程建设、生境破坏及过度捕捞等原因, 兰州鲇野生种群数量逐年下降,被《中国物种红色名录》列为濒危物种[4], 有效保护和科学利用这一重要生态位重点保护经济鱼类种质资源成为黄河生态文明建设的重要内容之一。目前已开展野生驯养和人工繁育等试验研究及定期增殖放流等保种救护工作[2,3,5], 但传统活体保种中面临着可能产生的世代间隔、基因丢失和遗传漂变等常见问题。

超低温冷冻保存技术是动植物种质资源保护最直接有效的方法之一[6], 目前鱼类遗传材料保存相关领域的研究主要集中在鱼类精子冻存与复苏等方面[7], 迄今已相继建立200多种鱼类精子冷冻保存技术[8], 斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)[9]、蓝鲶(Ictalurus furcatus)[10]及黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[11]等多种鱼类精子超低温冷冻保存技术已用于实际生产。但由于不同鱼类其精子结构、渗透压、pH及精浆成分等生理特性差异, 很难找到一种通用方法[12], 目前尚未见兰州鲇精子冷冻保存相关研究报道。为进一步加强兰州鲇这一濒危特有经济鱼类种质救护、保种和可持续利用, 本文通过开展兰州鲇精液超低温保存抗冻剂与冻存、解冻技术相关研究, 探讨冷冻和解冻对精子的损伤机制,以期为兰州鲇种质资源保护和新品种开发提供一定理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用兰州鲇采自宁夏回族自治区水产研究所国家级黄河鲶原种场, 选择健康体质健壮且无病无伤的性成熟雄性亲鱼, 鱼用促黄体生成素释放激素类似物A2(LRH-A2)和地欧酮(DOM)注射(2.5 μg/kg LRH-A2+1.5 mg/kg DOM)催产12—16h后, 用指压法采集精液, 镜检精子活力大于85%以上精液用本实验室自制保存液C液(柠檬酸钠三钠34 mmol/L、葡萄糖146.5 mmol/L、氯化钾4 mmol/L、碳酸氢钠23.80 mmol/L、青霉素80万IU/L和链霉素100万IU/L)稀释8倍, 置于4℃培养箱冷藏备用。

1.2 抗冻剂筛选

根据预试验结果, 分别设置二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)及甲醇(Methyl alcohol,MeOH)5%、10%、15%及20% 四个浓度组, 设置N,N-二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide, DMF)3%、5%、10%及15% 四个浓度组, 每组设置3个重复。吸取1 mL的精液保存液(稀释精液添加抗冻剂)至细胞冻存管, 4℃平衡30min, –80℃平衡30min后迅速投入液氮中冷冻保存。24h后从液氮中快速取出冻存管, 置于37℃水浴摇晃解冻至冰晶刚融化, 立即吸取2.5 μL精液加10 μL去离子水(曝气24h)混合进行精子激活, 置于光学显微镜下测定精子激活率(激活后运动精子数量占全部精子数量的百分比), 每个样本重复检测3次。

1.3 程序冻存与解冻处理条件筛选

以1.2中筛选获得的最佳抗冻剂及最佳浓度配制精液冻存液, 依次分别开展冻存中4℃平衡时间、–80℃平衡时间和解冻温度筛选等3个单因素分析试验。其中: 4℃平衡时间筛选设置0、10、20、30和40min五个处理组(n=3), 其他方法同1.2;固定筛选获得的最优4℃平衡时间条件, 设置0、15、30、45和60min5个处理组(n=3)进行–80℃平衡时间条件筛选, 其他方法同1.2; 固定筛选获得的最优4℃和–80℃平衡时间条件, 设置27℃、32℃、37℃、40℃、42℃5个处理组(n=3)进行适宜解冻温度筛选, 其他方法同1.2。

1.4 冻存损伤检测

以鲜精为对照, 采用3种方法进行最佳程序冻存与解冻条件处理后精子冻存损伤检测。对邓爽等[13]单细胞凝胶电泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE)方法改进后进行核DNA损伤检测(n=100),Nikon TE2000荧光显微镜于绿光激发光下观察并拍摄彗星图片。采用扫描电镜(Scanning electron microscope, SEM)法和透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)法[14]观察冻精超微结构损伤。

1.5 统计学处理

彗星图像用CASP软件分析获得尾部DNA含量百分比(DNA in Tail)、Olive尾距 (Olive tail moment, OTM)等比例参数评估精子DNA损伤(Sperm DNA fragmentation, SDF)。将兰州鲇精子核DNA损伤程度按照彗星尾部DNA含量百分比分为5级:G0级为＜5%, G1级为5%—20%, G2级为20%—40%,G3级为40%—95%, G4级为＞95%, 彗星率=(彗星细胞数目/总细胞数目)×100; 损伤系数=[(G0级损伤的细胞个数×0)+(G1级损伤的细胞个数×1)+(G2级损伤的细胞个数×2)+(G3级损伤的细胞个数×3)+(G4级损伤的细胞个数×4)]。

试验数据分析采用Excel整理, 通过SPSS21.0软件单因素方差分析(One-way ANOVA)检验各组精子活力的差异显著性, 统计结果以Mean±SD表示。

2 结果

2.1 抗冻剂种类与浓度对精子冷冻保存效果的影响

不同抗冻剂对兰州鲇精液冷冻保存试验表明(图 1), 各组激活率与鲜精差异显著(P≤0.05), 且3种抗冻剂对精子保护效果随浓度增加呈先升后降的趋势。DMF抗冻剂组中5% DMF冻精激活率(37.78±7.54)%显著高于其他3个浓度(P≤0.05)。15% MeOH组冻精激活率为(36.67±3.53)%, 显著高于MeOH抗冻剂组其他3个浓度组(P≤0.05)。DMSO抗冻剂组中10% DMSO对兰州鲇精子保护效果最好, 激活率达(52.78±7.54)%, 显著高于其他各组(P≤0.05)。5% DMF、5% DMSO、15% DMSO及15% MeoH组激活率相比无显著差异(P＞0.05), 但显著低于10% DMSO组(P≤0.05)。

2.2 4℃平衡时间对精子冷冻保存效果的影响

4℃平衡时间对兰州鲇精子冷冻保存效果影响(图 2A), 平衡时间20min时激活率最高, 达(69.44±8.45)%, 平衡10min与30min冻精激活率差异不显著(P＞0.05), 但显著低于20min组(P≤0.05), 平衡时间40min冻精激活率显著低于10 min和30 min, 不平衡组冻精激活率最低, 为(11.11±4.86)%, 各组冻精激活率与鲜精相比均差异显著(P≤0.05)。

2.3 –80℃平衡时间对精子冷冻保存效果的影响

兰州鲇精子−80℃平衡时间为30min时激活率最高(图 2B), 达(71.66±7.52)%, 其次是15min, 激活率为(54.16±8.61)%, 两者之间差异显著(P≤0.05),平衡时间45min与60min激活率差异不显著(P＞0.05), 但显著低于15min、30min组(P≤0.05), 未平衡组仅可见个别精子被激活, 冻精激活率为(0.33±0.52)%, 各组冻精激活率与鲜精相比差异均显著(P≤0.05)。

图 1 不同抗冻剂不同浓度对兰州鲇精子超低温冷冻保存效果的影响Fig. 1 Effects of different antifreeze agents on cryopreservation of spermatozoon in S. lanzhouensis

2.4 解冻温度对精子冷冻保存效果的影响

解冻温度对兰州鲇精子冷冻保存影响(图 2C),随解冻温度升高精子激活率呈先升后降趋势, 40℃组冻精激活率(75.56±3.91)%最大, 显著高于27℃、32℃和37℃组(P≤0.05), 与42℃组冻精激活率(68.89±3.33)%差异不显著(P＞0.05); 32℃、37℃和42℃组冻精激活率差异不显著(P＞0.05), 27℃组冻精激活率显著低于其他组(P≤0.05), 各组冻精激活率与鲜精相比差异均显著(P≤0.05)。

2.5 兰州鲇鲜精及冻精核DNA损伤SCGE检测

如图 2D所示, 10月份采集鲜精激活率相较于7月份显著降低(P≤0.05), 与7月份冻精激活率相当(P＞0.05); 10月份冻精与7月份冻精差异显著(P≤0.05)。10月份采集兰州鲇精液用最优组冻存方法冻存1个月, 鲜精及冻存10d、20d、30d冻精进行SCGE检测, 将精子分为5级: G0级精子正常的非彗星样细胞, 精子核完整(图 3A); G1级精子核缩小可见慧尾, 轻度损伤(图 3B); G2级精子核进一步缩小,彗尾明显延长, 中度损伤(图 3C); G3级精子属于重度损伤, 精子核明显缩小, 彗尾较长(图 3D), 未见G4级完全损伤精子, 计算各级别精子占精子总数百分比, 同时统计彗星率和损伤系数。结果如表 1所示, 冻精与鲜精相比G0级精子差异显著(P≤0.05),G1、G2和G3级精子增多但无显著差异, 10d、20d和30d冻精各级精子差异均不显著(P＞0.05), 鲜精彗星率、损伤系数与冻精有显著差异(P≤0.05),但各冻存组之间差异不显著(P＞0.05)。

2.6 兰州鲇精子冻存形态与超微结构损伤分析

应用扫描电镜检测法进行兰州鲇精子冻存形态结构损伤分析, 结果表明: 鲜精中27%精子形态结构异常, 冻精中47.4%精子形态结构异常。兰州鲇正常精子结构属于鞭毛型, 由头部、中段和尾部组成, 无侧鳍, 头部圆球形, 直径约(1.57±0.08) μm, 中段明显, 呈袖套状, 长径约(1.23±0.12) μm, 短经约(0.52±0.12) μm, 尾部鞭毛细长约(41.92±3.39) μm, 核膜与质膜平滑完整(图 4A)。冻存对兰州鲇精子形态结构的损伤主要表现为: 冻存损伤精子整体未发生膨胀, 但存在头部细胞膜出现破损(图 4B和4C)、皱缩凹陷变形(图 4D)、中段袖套结构破裂、线粒体脱落(图 4B)和尾部鞭毛发生断裂(图 4B)的情况。

应用透射电镜检测法进一步分析冻存对兰州鲇精子超微结构损伤情况, 结果表明: 正常兰州鲇精子头部主要由细胞核构成, 外部可见清晰质膜包裹, 前端无顶体或类似顶体膜结构。细胞核与质膜之间空隙含有极少细胞质, 无其他细胞器(图 5A和5B)。核内染色质致密, 核空泡位置、形状和大小不定, 头部后端有一植入窝, 含有由近端中心粒和基体(又称远端中心粒)两部分组成中心粒复合体,近端中心粒紧贴核膜, 近端与远端中心粒处于同一直线, 且其长轴相互垂直, 呈“T”形(图 5A)。中段袖套结构紧连头部尾端, 围绕尾端轴丝近似对称分布,富含线粒体, 线粒体及其他细胞器分层排列(图 5C)。袖套与轴丝之间空腔为袖套腔。尾部(鞭毛)发生于基体, 尾部的横切面呈卵圆形(图 5D), 直径0.26—0.30 μm, 由轴丝及附属纤维构成, 轴丝由9组外周纤维和2条中央纤维组典型的“9+2”微管结构, 无侧鳍(图 5D)。冻存后部分精子超微结构发生了不同程度的损伤, 主要表现为膜损伤, 细胞质与染色质膜发生破损、折皱、囊泡化或整体脱落(图 5E和5F), 细胞核与质膜空隙加大, 核质疏散(图 5E和5G), 线粒体结构弥散, 线粒体内容物外流(图 5E和5G), 中心粒复合体发生易位(图 5E), 鞭毛外膜变形脱离, 发生断裂(图 5H), 微管结构基本完好(图 5I)。

图 2 不同平衡时间、解冻温度及采集时间对兰州鲇精液激活率的影响Fig. 2 Effects of different equilibrium time defrost temperature and collection time on semen activation rate of S. lanzhouensis

图 3 精子单细胞凝胶电泳(SCGE)图Fig. 3 Comet image of spermatozoon

3 讨论

3.1 抗冻剂种类及浓度对精子活力的影响

随着水产业快速发展以及种质资源保存、杂交育种和新品种选育等工作的开展, 鱼类精液超低温保存技术研发与应用越来越广泛。超低温保存中通过添加适宜抗冻剂可降低细胞内电解质浓度,减少冰晶损伤, 从而大大提高了保存效果, 延长了保存时间。但鱼类精子具有种属特异性, 同种抗冻剂对于不同鱼类精子渗透性和毒性不同, DMSO、DMF及MeOH是3种淡水鱼类精子冷冻保存常见的渗透性冻存剂。DMSO具有高渗透性, 易和精子膜上磷脂层相互作用, 是目前使用最多的鱼类精子冷冻保存抗冻剂之一, 同时DMSO渗入致使细胞内外渗透压相差太大, 精子细胞可能发生溃解[15], 产生毒性。在鲻(Mugil cephalusLinnaeus)[16]、虹鳟(Oncorhynchus mykissWalbaum)[17]、中国花鲈(LateolabraxjaponicusMcClelland)[18]及Nandus nandus(Hamilton, 1822)[19]等多种鱼类精子冷冻保存中,DMSO浓度为8%—12%时对冻精保护作用最好, 且对精子毒性存在剂量依赖性。本研究DMSO对兰州鲇冻精保护效果高于DMF和MeOH, 10% DMSO效果最好, 且随着浓度增加冻精激活率递减, 这一结果与前述研究结论一致。相对而言DMF和MeOH对兰州鲇冻精保护效果不及DMSO, 与姜仁良等[20]研究发现13% DMF超低温冻存团头鲂、鲤、草鱼及鲢精液受精率高于13%DMSO的结果相悖, 亦与刘光霞等[8]发现圆口铜鱼(Coreius guichenotiSauyage et Dabry)精子超低温冻存研究中10% MeOH冻精活力高于DMF和DMSO的研究结果相悖, 可能原因是精子自身适应能力不同和对抗冻剂渗透性不同, 造成DMF和MeOH不适于兰州鲇精液保存。

表 1 兰州鲇冻精SCGE检测的DNA损伤分级Tab. 1 DNA damage of frozen semen of S. lanzhouensis by SCGE

图 4 兰州鲇精子冻存损伤扫描电镜观察Fig. 4 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by SEM

3.2 冷冻程序对精子活力的影响

4℃平衡一段时间有利于精子超低温冻存时冻存剂充分渗透进精子细胞降低冰晶损伤, 但随平衡时间增长抗冻剂对精子细胞毒性作用也会增强, 适宜的平衡时间有利于抗冻剂对精子起到良好保护作用。同类抗冻剂对不同鱼类精子渗透性不同, 不同鱼类4℃平衡时间也不同。黄颡鱼[11]、北梭子鱼(Esox lucius)[21]及匙吻鲟(Polyodon spathula)[22]等鱼类4℃平衡10—15min对精子有良好保护效果, 圆口铜鱼[8]4℃平衡25min后冷冻保存效果较好, 而光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)[23]精子4℃下平衡30min有较好的冷冻保存效果。本研究中4℃处理20min为兰州鲇精子适宜的冷冻保存前平衡时间。

超低温冷冻保存过程中降温速率太快, 精子细胞中水分来不及渗出易形成冰晶, 损伤精子细胞器及细胞膜, 造成精子运动速率下降及死亡。于–80℃平衡过渡可降低精子因直接放入–196℃液氮形成冰晶造成精子损伤及死亡。Nahiduzzaman等[24]将蓝黑鲮(Labeo calbasuHamilton)精子以程序降温法从5℃降到–80℃超低温保存, 冻精激活率为75%。丁淑艳等[25]将兴国红鲤(Cyprinus carpio var singuonensis)精子于–80℃平衡15min后保存至液氮中, 解冻后精子活力达83%。本研究中兰州鲇精液于–80℃平衡30min, 冷冻效果效果最好, 直接投入液氮冻精几乎全部死亡, 这一结果与前述结论相符。

解冻是冷冻的逆过程, 损伤机制与冷冻损伤类似, 解冻过程渗透压变化造成精子细胞器损伤, 进而影响精子成活率[8]。不同鱼类冻精的解冻温度因冷冻工艺不同而异, 精子冷冻保存速率越快, 解冻温度越高, 常用的解冻温度是30—40℃水浴解冻,适宜的解冻温度可以使精子度过损伤敏感区[23]。在本研究中, 40℃水浴解冻兰州鲇精子活力较佳,温度过高过低都会影响精子活力, Muthmainnah等[26]在39—40℃水浴解冻纵带纹唇鱼(Osteochilus vit-tatusValenciennes)冻精, 史应学等[18]在40℃水浴中解冻中国花鲈冻精, 37℃水浴解冻斑鳜(Siniperca scherzeriSteindachner)精子获得了较高精子成活率[12]。

图 5 兰州鲇鲜精及冻精透射电镜观察Fig. 5 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by TEM

3.3 冻精与鲜精核损伤检测

精子DNA损伤情况是检测精子质量的一个重要依据。Miskolczi等[27]研究证明冷冻损伤精子基因组在受精过程中不参与胚胎发育, 致使非洲鲇形成单倍体个体。单细胞凝胶电泳是一种检测细胞DNA损伤的经典方法, 具有灵敏度高、简便、经济和快速等各种优点。细胞通过裂解和DNA解链等过程, 经电泳使损伤的DNA从细胞核中溢出, 向阳极泳动, 形成尾状带, 即彗尾, 未损伤的DNA部分保持球形, 两者共同形成“彗星”[28,29]。在本实验过程中按照徐西长等[30]的方法进行多次单细胞凝胶电泳, 最后都未跑出彗星图, 而按照邓爽等方法得到清晰彗星图像, 可用于兰州鲇精子DNA损伤检测。

SCGE检测的兰州鲇精子于10月9日采集, 此时已错过繁殖期, 鲜精活力只有79%, 显著低于7月份96%, 且精子超低温冻存损伤程度明显高于7月份精子。该研究结果与Pérez-Cerezales等[31]研究虹鳟不同季节精子DNA碎片率发现的精子冷冻前差异更容易受到低温损伤结果一致。因此冻精DNA损伤可能由冷冻工艺和精子冷冻前差异两个原因造成, 所测得彗星率与损伤系数会较7月份冻精高。一般认为, 精子在液氮(–196℃)中处于休眠状态, 保存时间长短对精子质量无显著影响。史应学等[32]发现, 中国花鲈精子超低温冻存30d后活力无显著差异, 陈松林等[33]用塑料管法长期保存(1年)与短期保存的鲤、草鱼和鲢冻精激活率均在70%左右。周磊等[12]将斑鳜精子液氮保存2—30d的激活率、杂交受精率和孵化率均无显著差异。本实验兰州鲇精子超低温冻存10—30d激活率、DNA损伤彗星率和损伤系数无显著差异, 结合相关研究推测精液在液氮中保存时间的长短对冻精影响不大, 但仍需在后续研究中进一步验证。

3.4 鲜精及冻精超微结构

硬骨鱼类精子主要由头部, 中段和尾部组成,细胞核为头部主要结构, 中段由中心粒复合体和袖套构成, 尾部鞭毛是其主要运动器官。多种鱼类研究表明, 普通形态学与精子超微结构结合运用于鱼类系统发育分析为物种分类提供依据, 同一科或亚科的鱼类精子结构分布模式有很高的相似性, 存在系统发生的联系[34,35]。扫描电镜和透射电镜观察发现兰州鲇精子可明显分为头部、中段和尾部, 与索氏六须鲇(Silurus soldatovi)[36]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[37]等鲇科鱼类相同。兰州鲇球形或椭圆形的精子头部形态与索氏六须鲇[36]、南方鲇[37]和鲇(Silurus asotus)[38]相似, 主要由细胞核构成, 核质致密。头部后端有一植入窝含有中心粒复合体, 中心粒轴丝相互垂直呈“T”形, 远端中心粒向外延伸出尾部轴丝。中段由袖套及中心粒复合体组成, 接连细胞核后端。尾部与南方鲇[37]、鲇[38]和埃及尼罗河鲇[39]等大多数鲇形目鱼类一样, 具单鞭毛和无侧鳍, 不同于棘甲鲶科的韦氏上棘鮠和钝囊鲶属鱼类的双鞭毛[40]及黄颡精子单鞭毛的两排侧鳍[41]。本研究通过超微形态结构分析, 发现超低温冻存解冻主要造成兰州鲇精子膜、线粒体和鞭毛损伤, 同大多数硬骨鱼类精子超低温冻存损伤一样主要为机械损伤。张雪雷等[42]研究发现大菱鲆超低温冻存损伤中60%—70%精子为膜损伤, 而膜损伤主要包括结构损伤和化学损伤[43]。结构损伤主要由于降温过程中细胞内水分未完全脱出形成冰晶,损伤膜蛋白及脂类。化学损伤则主要因冷冻过程中细胞外物质先结冰、细胞内发生脱水、pH与离子浓度等细胞内环境变化及大分子复合物解体, 造成膜结构破损、折皱、囊泡化或整体脱落等不可逆损伤[42,44]。本研究中兰州鲇冻精发生的细胞质膜和染色质膜破损、折皱、囊泡化或整体脱落, 细胞核与质膜空隙加大等超微结构变化证实了这一观点。鞭毛是精子运动胞器, 袖套内线粒体则为精子运动的供能场所。中国大鲵(Andrias davidianus)[45]冻精超微结构观察发现线粒体嵴变形、轴丝弯曲和质膜膨胀等直接导致冻精活力和复苏率下降。本研究中冻精线粒体结构损伤、中心粒复合体易位和鞭毛外膜变形脱离同样也严重影响鞭毛运动性能, 引起精子活力和受精率下降。本研究中鞭毛微管结构未发生损伤, 但鞭毛与中段连接处发生断裂, 这是因为鞭毛与中段2种不同的胞骨架连接处结构脆弱, 造成脱节, 与西伯利亚鲟(Acipenser b.baerii)[43]损伤结果一致。