2型糖尿病患者血浆褪黑素水平与糖尿病视网膜病变的相关性研究△

万伟伟 龙洋 刘宏卓 万文萃

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症，糖尿病患者中DR患病率高达51.3%，是工作年龄阶段失明的主要原因[1-2]。目前现有的诊治手段不能有效避免DR的进展，早期筛查在DR的诊治中具有重要的意义。生物标志物现已被用于各种疾病的诊断和分类中，包括糖尿病和DR[3]。褪黑素是一种内源性吲哚胺类物质，由松果体和部分视网膜合成，具有抗氧化和抗凋亡作用，与多种代谢性疾病有关，对脑、心、肝等重要器官具有保护作用。有研究发现褪黑素在DR的治疗中具有潜在的作用[4-5]。目前，国内外有关血浆褪黑素浓度与DR相关性研究很少见。因此，本研究通过检测2型糖尿病患者血浆中褪黑素浓度，旨在分析其与DR的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料采用前瞻性病例对照研究。收集2020年5月至10月于郑州大学第一附属医院筛查糖尿病者300人。其中，体检确认无糖尿病者118人为对照组，确诊为2型糖尿病并于眼科就诊的182例患者为研究组。将研究组患者再分为无DR组(NDR组 57例)、非增生型DR组(NPDR组 64例)和增生型DR组(PDR组 61例)。2型糖尿病的诊断依据2019年美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA )标准[6]。根据眼底照相及裂隙灯检查对DR进行诊断和分类，依据2019年美国眼科学会《糖尿病视网膜病变临床指南》进行分级。纳入标准：(1)健康对照或2型糖尿病伴或不伴DR;(2)能够配合科研活动;(3)研究前签署知情同意书。排除标准:(1)诊断为1型糖尿病;(2)精神障碍或严重睡眠障碍患者;(3)近2周口服褪黑素补充者。本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准(批文号：2020-KY-395)，所有受试者在研究前均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般资料与生化指标获取方法通过咨询受试者获得所有研究对象基本资料，如年龄、糖尿病病程、高血压史、吸烟史、饮酒史等。根据体质量计算每名研究对象体质量指数(BMI)。生化指标：如甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清总胆红素(Tb)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、25羟基维生素D3[25(OH)VitD3]和甲状旁腺激素(PTH)，从院内检查系统中提取。DR的诊断由两名眼科专家结合眼底照相及眼底检查进行独立诊断，并在进一步分析前行一致性检查。

1.2.2 血样采集与褪黑素浓度检测收集对照组、NDR组、NPDR、PDR组所有研究对象早晨800血液样本2 mL，静脉血标本置于装有乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中，置于冰上，4 ℃ 3000 r·min-1离心15 min获得血浆标本。使用前将所有血浆样本放入冻存管(1.5 mL)，-80 ℃保存。为测定血浆中褪黑素的浓度，样品采用人褪黑素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Glory Science Co.， Ltd，TX，美国)进行检测。每个样本检查3次，取其平均值将用于最终的数据分析。分析评估两组研究对象间基本资料的可比性，测量并记录各组研究对象血浆褪黑素浓度。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用配对t检验，三组以上差异检测采用单因素方差分析。定性资料比较采用卡方检验。采用受试者特征曲线(ROC)检验相关指标的有效性。Spearman分析褪黑素浓度与其他各检测指标的相关性，Logistic 回归分析NPDR及PDR可能的危险因素。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组一般资料及生化指标比较各组研究对象间性别分布差异无统计学意义(P=0.947)；而对照组、NDR组、NPDR组、PDR组研究对象年龄比较，NPDR组、PDR组患者年龄均大于对照组(均为P<0.001)。各组研究对象间BMI差异有统计学意义(P=0.047)，SBP、DBP和MAP差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)，而PDR组患者高血压患病率较高。NDR组、NPDR组、PDR组患者糖尿病病程、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1C)含量比较，差异也均有统计学意义(均为P<0.001)。各组研究对象间TG、TC、LDL-C、HDL-C和PTH差异均无统计学意义(均为P>0.05)。此外，各组研究对象间Tb、hs-CRP、Hcy及25(OH)VitD3差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 各组一般资料及生化指标比较

2.2 血浆褪黑素水平与DR的相关性分析对照组、NDR组、NPDR组及PDR组人员血浆褪黑素浓度分别为(72.83±16.25)ng·L-1、(60.38±13.43)ng·L-1、(44.48±10.30)ng·L-1和(44.69±8.95)ng·L-1，组间差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比，NDR组患者血浆褪黑素浓度较低(P<0.001)。与NDR组相比，NPDR组和PDR组患者血浆褪黑素浓度较低(P< 0.001)。通过ROC曲线分析检测血浆褪黑素浓度对DR的诊断作用，发现血浆褪黑素浓度可作为潜在的诊断DR的生物标志物(AUC=0.893，P<0.001)，且cut off为0.685时敏感度为0.896、特异度为0.789(见图1A)；通过分析NPDR组、PDR组、NDR组的ROC曲线，发现血浆褪黑素水平对糖尿病患者中DR的诊断作用，cut off为0.593时敏感度为0.856、特异度为0.737(见图1B)；与对照组相比可发现血浆褪黑素浓度对诊断DR患者具有很高的敏感度和特异度(见图1C、D、E)。

图1 各组血浆褪黑素水平及ROC曲线 A:NPDR组+PDR组 vs NDR组+对照组的ROC曲线，cut off为0.685时敏感度为0.896、特异度为0.789；B:NPDR组+PDR组 vs NDR组的ROC曲线，cut off=0.593时敏感度为0.856、特异度为0.737；C:NPDR组vs对照组的ROC曲线，cut off为0.738时敏感度为0.891、特异度为0.847；D:PDR组vs对照组的ROC曲线，cut off为0.773时敏感度为0.934、特异度为0.839；E:NPDR组+PDR组vs对照组的ROC曲线，cut off为0.751时敏感度为0.912,特异度为0.839。

2.3 DR患者生化指标与NPDR/PDR风险的相关性分析为了分析不同分期DR的生化指标危险因素，本研究进一步分析了FBG浓度、HbA1C含量、血清Tb、血浆褪黑素浓度、hs-CRP、Hcy、25(OH)VitD3、PTH与NPDR/PDR发病风险的相关性。结果显示，较高的hs-CRP、FBG和较低的褪黑素浓度、25(OH)VitD3均与NPDR风险增加相关(均为P<0.001)；在对PDR风险检测的进一步分析中发现，较高的HbA1C含量、hs-CRP和较低的25(OH)VitD3是PDR的危险因素(均为P<0.001)(见表2)。

表2 生化指标和NPDR/PDR风险之间的多因素Logistic回归分析

2.4 生化指标与血浆褪黑素浓度的相关性血浆褪黑素浓度可作为DR诊断的特异性指标，进一步研究生化指标与血浆褪黑素浓度之间的关系。研究结果显示，PTH与血浆褪黑素浓度无相关性(r=0.014,P=0.808)；FBG、HbA1C含量、hs-CRP和Hcy与血浆褪黑素浓度均呈负相关(r=-0.464、-0.481、-0.663、-0.607,均为P<0.001)；血清Tb、25(OH)VitD3与血浆褪黑素浓度均呈显著正相关(均为P<0.001)(见表3)。

表3 生化指标与血浆褪黑素浓度的相关性

2.5 血清Tb和褪黑素浓度之间的关系基于血清Tb和褪黑素浓度之间存在显著正相关关系，在不同组别中对这一关系进行了更深入研究，结果显示：在所有受试者中，血清Tb和褪黑素浓度之间存在显著的线性相关(R2=0.438，P<0.001)。考虑到不同的DR分期，NPDR组和PDR组患者血清Tb与褪黑素浓度之间存在显著相关性(R2=0.360、0.183，均为P<0.001)(见图2)。

图2 各组受试者血清Tb与血浆褪黑素浓度的线性关系 A:所有受试者血清Tb与血浆褪黑素浓度的线性分析;B:NPDR组患者血清Tb与血浆褪黑素浓度的线性分析;C:PDR组患者血清Tb与血浆褪黑素浓度的线性分析。

3 讨论

在本研究中，我们发现对照组与研究组对象间血浆褪黑素浓度不同，并且与对照组和NDR组相比，NPDR组和PDR组患者血浆褪黑素浓度明显降低。通过ROC曲线分析发现血浆褪黑素浓度对DR的诊断效果具有高度敏感性和特异性。因此可以认为：血浆褪黑素可以作为DR的灵敏度较高的诊断标志物。本研究相关分析发现，对照组和研究组受试者血清Tb与血浆褪黑素浓度呈正相关。hs-CRP的增高和25(OH)VitD3的降低均与DR的进展有关。各组研究对象间Hcy的差异具有统计学意义，但与DR患病风险的研究中无明显的相关性。另外，PTH与DR的患病风险无明显的相关性。

生物标志物在DR诊断中的价值越来越引起人们的重视，国内有报道称衰老标记蛋白30的降低与DR的进展有关，并可作为DR早期的干预靶点[7]。Platania等[8]的研究中一组miRNA被确定为DR的潜在诊断标记物。有报道称中国2型糖尿病患者的血清CA125水平与DR的存在和严重程度相关[9]。以上研究为诊断DR生物标志物的开发提供了可行性保障。褪黑素作为一种对哺乳动物生物节律起重要调节作用的激素被大家所熟知[10]。有研究表明，褪黑素具有重要的调节作用，并进一步预防各种疾病，包括心血管疾病、神经血管疾病和糖尿病，包括继发于糖尿病的并发症[11]。也有研究表明PDR患者褪黑素分泌减少[12]，因为褪黑素作为抗氧化剂/线粒体保护因子和炎症因子，可能导致DR的进展。本研究与此不一致的是，与对照组和NDR组相比，NPDR组患者血浆褪黑素浓度降低。这可能因为本研究的样本量相比以上研究较大，ELISA检测方法可能导致两项研究结果差异。

本研究中所有受试者血清Tb与血浆褪黑素浓度呈显著正相关。胆红素是由血红素分解代谢产生的，研究发现其对血管具有抗炎和抗氧化作用[13]。国内有研究认为[14]，在2型糖尿病患者中，女性的Tb水平与DR的患病风险存在U形关系，而男性患者Tb水平与DR的患病风险存在负相关关系[15]。Zhu等[16]在一项基于1637位受试者的横断面研究中发现，DR患者的血清Tb水平明显低于2型糖尿病患者。还有学者认为，较高水平的Tb对DR具有保护作用。胆红素和褪黑素在DR的进展中生理作用相似，这可能是二者之间呈正相关的原因。在血浆褪黑素浓度的Spearman分析中还发现，FBG、HbA1C、hs-CRP、Hcy与血浆褪黑素浓度均呈负相关关系，而25(OH)VitD3与血浆褪黑素浓度呈正相关。国内外有研究表明hs-CRP是一种主要由肝脏合成的蛋白质，提示其是全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，可加速DR的进展[17-18]。Hcy是一种血管损伤性氨基酸，可以充分反映血管病变情况，且与2型糖尿病患者血管病变有一定相关性[19-20]。Alcubierre等[21]研究发现，25(OH)VitD3浓度与DR相关，且浓度越低DR的进展越严重。本研究结果与其相符，且进一步证明了血浆褪黑素浓度是诊断DR的敏感指标。

综上所述，本研究发现DR患者血浆褪黑素浓度降低，血浆褪黑素可作为诊断DR的敏感、特异指标，血清Tb与褪黑素浓度呈显著正相关，而hs-CRP、Hcy与血浆褪黑素浓度均呈负相关关系，而25(OH)VitD3与血浆褪黑素浓度呈正相关。本研究的局限性在于纳入样本量小和未进行长期的随访。此外，褪黑素的分泌具有昼夜节律性，本研究中所有受试者只选择了一个标准时间点，接下来的研究中我们将进一步检测更多的时间点，以利于测量褪黑素分泌的昼夜节律；同时进行合理的研究设计并构建动物模型，进一步探究褪黑素对DR的保护作用及具体的分子机制。