龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的调控作用△

殷学伟 郭励劼 周梦贤 邱岩 毕宏生 郭大东

葡萄膜炎是一类临床常见、不可逆、具有致盲性的复发性自身免疫性眼病，病因复杂，且其发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，葡萄膜炎多采用激素和免疫抑制剂药物治疗，副作用较大。因此，深入探讨葡萄膜炎的发病机制以及发现新的治疗靶点对葡萄膜炎的临床治疗具有重要意义。龙胆泻肝汤(Longdan Xiegan decoction,LXD)是由龙胆草、山栀子、泽泻、黄芩、木通、车前子、生地黄、柴胡、当归和生甘草共十味中药组成，具有较强的免疫调节作用[2]；临床研究发现，LXD对前葡萄膜炎有较好的治疗作用[3]。此外，LXD可通过多种途径改善机体的免疫反应，从而有效减少实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠前房炎症细胞浸润，保护眼部组织结构，促进机体免疫功能恢复[4]，但是LXD对葡萄膜炎免疫平衡的调控机制仍不十分清楚。巨噬细胞是先天固有免疫的重要组成部分，在炎症和宿主防御中发挥核心作用。在不同的病理生理条件下，巨噬细胞可转化为不同的功能表型，即经典活化性巨噬细胞(classically activated macrophages，M1)和选择活化性巨噬细胞(alternatively activated macrophages，M2)[5]。研究发现，M1/M2巨噬细胞极化的不平衡通常与各种炎症性疾病密切相关。抗炎症的 M2 型巨噬细胞的减少和促炎症的M1型巨噬细胞的增加与炎症性疾病及自身免疫性疾病的发生有关。M1型巨噬细胞主要参与启动和维持炎症反应，而M2型巨噬细胞主要参与炎症消退[6]。失衡(增加)的M1/M2巨噬细胞比例是推动自身免疫性疾病发生发展的重要病理因素[7]。考虑到M1/M2巨噬细胞平衡在炎症性疾病中的重要作用，本研究拟通过检测LXD干预12 d前后EAU大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞和iNOS、Arg-1的mRNA及蛋白表达的变化，分析LXD对EAU大鼠M1型、M2型巨噬细胞极化的影响，探讨LXD对EAU大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的调控作用，为EAU的临床治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)(生工生物工程股份有限公司，上海)；结核分枝杆菌(TB)(Difco公司，美国)；完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma公司，美国)；LXD配方颗粒(华润三九医药股份有限公司)；Genesis-D动物眼部照相机(Kowa公司，日本)；RNA提取试剂盒(Aidlab公司，北京)；大鼠脾脏单核细胞分离液试剂盒(Solarbio公司，北京)；逆转录试剂盒、Q-PCR试剂盒(QIAGEN 公司，德国)；FITC-F4/80(博奥森生物技术有限公司，北京)；APC-CD11b(钰博生物科技有限公司，上海)；PE-CD86(eBioscience公司，美国)；PE-CD206(圣克鲁斯生物技术有限公司，上海)；固定破膜试剂盒(BD公司，美国)；大鼠ELISA(iNOS、Arg1) 试剂盒(Jianglaibio公司，上海) 。

1.1.2 实验动物分组及处理随机将48只健康Lewis雌性大鼠(鼠龄6～8周，体质量160～180 g，Charles Rive维通利华公司，北京)分为正常对照(NC)组、EAU模型组和LXD干预组，每组16只。EAU模型组和LXD干预组大鼠的足底、腹壁两侧和后背处分别注射200 μL含IRBP、CFA和TB的混合液以建立EAU大鼠模型，在NC组大鼠的相同部位分别注射相同含量的CFA及TB混合乳糜液(不含IRBP)。免疫后，LXD组大鼠每天按1000 mg·kg-1进行LXD灌胃干预，EAU模型组和NC组大鼠给予相同体积的PBS缓冲液灌胃，每天1次，直至大鼠处死。

1.2 Q-PCR检测各组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS和Arg-1 mRNA表达免疫后12 d，收集各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，进行组织RNA的提取和RNA反转录，引物序列：GAPDH 上游引物为5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，GAPDH下游引物为5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’，大小为222 bp；iNOS上游引物为5’-CTTCCGGGCAGCCTGTGAGACG-3’，iNOS下游引物为5’-ATCCCCAGGTGTTCCCCAGGTAGG-3’，大小为297 bp；Arg1上游引物为5’-CGGCTTGCGAGATGTGG-3’，Arg1下游引物为5’-TAGCCGGGGTGAATACTGG-3’，大小为200 bp。反应体系为每孔20 μL，反应条件为：95 ℃ 5 min，反应循环1次；95 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，循环45次。Q-PCR程序完成后，按 2-ΔΔCt计算iNOS和Arg1的mRNA相对表达水平。

1.3 ELISA法检测各组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS和Arg1蛋白表达免疫后12 d，收集各组大鼠的脾脏、淋巴结以及眼组织，液氮研磨后加入RIPA裂解液350 μL溶解，匀浆30 s，移至超声波组织细胞粉碎机中进行冰上超声20 min，然后置于4 ℃的离心机中8000 r·min-1离心10 min。BCA法检测并计算各组样品的蛋白浓度，采用商业用ELISA 试剂盒检测各组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织iNOS和Arg1的蛋白表达。

1.4 各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M1/M2巨噬细胞极化水平检测免疫后12 d，分别取三组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，收集单核细胞，加入细胞刺激液6 μL和蛋白酶转运抑制剂4 μL轻轻混匀，置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中，避光孵育5 h，首先进行细胞表面染色，然后将细胞固定破膜，进行细胞内染色，最后加入350 μL PBS将细胞重悬，滤网过滤，流式细胞仪检测各组样本中M1型、M2型巨噬细胞的表达水平，分析LXD对EAU大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，所有实验均重复3次，组内统计学差异比较均采用单因素方差分析，组间采用LSD检验进行两两比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS和Arg1的mRNA表达Q-PCR检测发现，免疫后12 d，与NC组相比，EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS mRNA相对表达水平均升高，Arg1 mRNA相对表达水平均降低(均为P<0.05)；与EAU模型组相比，LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS mRNA相对表达水平均显著降低，Arg1 mRNA相对表达水平均明显升高(均为P<0.05)(见表1)。

表1 免疫后12 d各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中iNOS和Arg1 mRNA的表达

2.2 各组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS和Arg1的蛋白表达ELISA法检测发现，EAU组和LXD组大鼠各组织中iNOS和Arg1蛋白相对表达水平变化趋势与mRNA相对表达水平基本一致。免疫后12 d，与NC组相比，EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS蛋白相对表达水平均明显升高，Arg1蛋白相对表达水平均明显降低(均为P<0.05)；与EAU模型组相比，LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS蛋白表达水平均显著降低，Arg1蛋白表达水平均明显升高(均为P<0.05)(见表2)。

表2 免疫后12 d各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中iNOS和Arg1蛋白表达

2.3 LXD对EAU大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响流式细胞仪检测结果显示，免疫后12 d,EAU模型组大鼠各组织中M1型巨噬细胞水平升高，而M2型巨噬细胞水平降低，M1/M2巨噬细胞极化比例均高于NC组，呈现不均衡状态；LXD干预组大鼠各组织M1型巨噬细胞水平下降，M2型巨噬细胞水平升高，两者比例逐渐恢复均衡(见图1、图2、表3)。

图1 流式细胞仪检测各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M1型巨噬细胞水平变化 A：圈门的P1为F4/80+CD11b+细胞；B：右上象限为F4/80+CD11b+CD86+ 巨噬细胞(M1型巨噬细胞)。

图2 流式细胞仪检测各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M2型巨噬细胞水平变化 A：圈门的P1为F4/80+CD11b+细胞；B：右上象限为F4/80+CD11b+CD206+巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。

表3 各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中M1型、M2型巨噬细胞水平以及M1/M2巨噬细胞比例变化

3 讨论

祖国医学认为，葡萄膜炎属“瞳神紧小”“瞳神干缺”等范畴，急性期以肝胆火炽型为主。LXD具有泻肝经实火、利肝胆湿热之功效，对急性期葡萄膜炎有显著疗效。本课题组前期研究显示，中西医综合治疗葡萄膜炎效果优于单纯西药治疗[8-9]，提出“火热为标，肝胆为枢，五脏为本”的葡萄膜炎病机理论，其中“肝性失柔，火热上炎”为其关键病机，以“清火柔肝明目，标本经枢兼调”治法取得较好的临床疗效[10]。因此，我们认为中医药治疗葡萄膜炎与调肝有关。肝主疏泄、主藏血，在维持机体正常功能和调节免疫平衡方面发挥重要作用，具有现代免疫学的基础。LXD可通过清肝火、调肝经促进机体恢复免疫平衡，达到治疗葡萄膜炎的目的。 LXD对葡萄膜炎等免疫性眼病具有良好的治疗作用。有研究显示，龙胆泻肝胶囊能显著降低葡萄膜炎患者外周血中 IFN-γ、TNF-α、IL-23 的水平，改善机体的免疫状态，表明LXD对葡萄膜炎有良好的治疗作用[3]。本课题组前期临床研究显示，LXD对葡萄膜炎的治疗在治愈率、随访 1年复发率、住院时间、不良反应、患者耐受性及依从性、症候积分改变率等多方面均优于单纯西药组[10]；前期实验研究发现，LXD可有效减少 EAU 大鼠前房的炎症细胞浸润，保护眼部组织结构，正向调节机体免疫功能[11]。因此，探讨LXD治疗葡萄膜炎的生物学本质，具有临床和实验研究的坚实基础。

巨噬细胞是一种重要的抗原提呈细胞,巨噬细胞参与的免疫机制可能与M1/M2巨噬细胞极化平衡相关。在LPS、IFN-γ等炎症因子刺激作用下,巨噬细胞可极化为M1型巨噬细胞，而巨噬细胞在Th2型细胞因子作用下可极化为促进损伤组织修复的M2型巨噬细胞[12-14]。巨噬细胞可通过在M1和M2功能表型中的改变作出环境信号反应[15]。Arg1为M2 型巨噬细胞的标志物，而iNOS为M1型巨噬细胞的标志物[16]。Arg1与iNOS作为巨噬细胞极化过程中的一对竞争性酶，二者可通过调控它们的表达和活性的动态平衡调节巨噬细胞的功能，M1型巨噬细胞可释放IL-6和IFN-γ等，进而间接激活STAT3，诱导巨噬细胞iNOS等炎症因子的表达，引起致炎因子的分泌增多，进而发生脓毒性休克和组织坏死[17-18]。M1/M2巨噬细胞极化的不平衡可影响炎症性疾病，包括自身免疫性疾病的发展进程。M1型巨噬细胞表达或分泌CD86、TNF-α以及iNOS等多种促炎因子，M2型巨噬细胞表达或分泌抗炎因子，如Arg1及IL-10等[19]。在自身免疫性疾病中，STAT6可刺激巨噬细胞发生M2型极化，进而调节Arg1抗炎因子的表达[20-21]。研究显示，IL-33可使肠系膜中的M2型巨噬细胞比例增高，进而诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，参与皮肤黏膜上皮组织损伤的修复以及重建黏膜免疫平衡过程[22]。Arg1可有效减少iNOS所生成的NO造成的机体损伤，对组织修复具有促进作用[23]。研究显示，M2型巨噬细胞表面标志物可参与抗炎、抗肿瘤以及抗氧化过程，发挥免疫调节作用[24]。

Kung等[25]研究发现，在类风湿性关节炎(RA)小鼠动物模型中，噻二唑-6,11-二酮可通过特异性抑制T细胞死亡相关基因8的功能和表达，调节M1/M2巨噬细胞极化平衡，减少关节炎症的疼痛和破坏，进而抑制RA的发生发展；花青素-3-O-β-葡萄糖苷(Cy-3-g)可通过过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)介导的NF-κB以及转录6信号通路的信号转导子和激活子调节M1/M2巨噬细胞极化平衡，降低促炎因子表达水平，提高抗炎因子表达水平，从而发挥抗炎作用[26]。本研究发现，与NC组相比，免疫后12 d的EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中iNOS mRNA及蛋白表达水平明显升高，而Arg1的mRNA及蛋白表达水平降低(均为P<0.05)，M1/M2巨噬细胞极化比例均高于NC组，呈现不均衡表达；经LXD治疗后，LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中iNOS 表达均显著降低，而Arg1 表达均明显升高(均为P<0.05)，M1型巨噬细胞极化水平下降，而M2型巨噬细胞极化水平升高，M1/M2巨噬细胞比例逐渐恢复均衡。提示LXD可通过调节M1型、M2型巨噬细胞的极化水平恢复EAU大鼠M1/M2巨噬细胞的极化平衡，从而发挥治疗EAU的作用。

总之，EAU大鼠的脾脏、淋巴结以及眼组织中iNOS水平显著升高，而Arg-1表达水平降低，M1/M2巨噬细胞极化平衡发生紊乱。LXD可明显降低M1型巨噬细胞极化水平以及相关因子iNOS表达水平，提高M2型巨噬细胞极化水平以及相关因子Arg-1表达水平，从而发挥对EAU大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的调控作用，达到治疗葡萄膜炎的效果。本研究为临床应用LXD治疗EAU提供了新的理论基础和依据。