吉安某猪场仔猪腹泻的病原分析及防治

2021-06-01刘凤飞唐岳

江西畜牧兽医杂志 2021年2期

刘凤飞，唐岳

（1.安福县农业农村局，江西吉安343200；2.永新县农业农村局）

仔猪腹泻一直是造成养殖业经济效益下降的多发性疾病，仔猪死亡率高且耐过猪生长发育受阻，并影响其肉质。仔猪腹泻的病因多种多样，可由各种细菌、寄生虫、病毒引起，大多数规模化猪场虽然有合理的免疫及驱虫程序，同样也有优质的饲料供应，但仔猪腹泻的情况仍然时有发生，这是多种致病因素综合作用的结果[1]。因此对不同的猪场的仔猪腹泻病例进行综合分析，提出相应的防治措施并落到实处才能有效预防此类疾病的发生。

在生产实践中，大肠杆菌感染引起的仔猪腹泻十分常见且多发。大部分大肠杆菌是动物肠道的正常菌群之一，动物刚出生时机体并没有大肠杆菌，需经过一段时间，经口进入动物消化道定居并可通过粪便长期排出体外，但也有部分特殊血清型的大肠杆菌具有致病性，对人及多种动物有较强的致病力[2]，如肠产毒素型大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌等。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞的直杆菌，两端钝圆，大多菌株以周生鞭毛运动。可在普通培养基上生长良好，在麦康凯琼脂培养基上形成红色菌落，在伊红美蓝培养基（EMB培养基）上形成黑色带金属光泽的菌落，这是大肠杆菌区别于其他杆菌的标志性现象[3]。

本实验在排除免疫失败、寄生虫、仔猪流行性腹泻病毒等致仔猪腹泻的病因后，用接种环刮取了病猪肠黏膜，接种于EMB培养基中，将培养基置于37℃恒温生化培养箱中培养了24 h，结果在EMB培养基上观察到了多量较单一的光滑型，黑色带金属光泽的菌落。继而将菌落制备细菌涂片，干燥，染色，镜检为革兰氏阴性球菌。因此高度怀疑某猪场仔菌腹泻是由大肠杆菌感染引起。

近年来，国内养殖场滥用抗生素现象十分严重，导致大肠杆菌的耐药谱不断扩大，为有效选取该猪场大肠杆菌敏感的抗生素，最后进行了药敏试验。结果显示该分离细菌对丁胺卡那（阿米卡星）敏感，对环丙沙星中度敏感，而对头孢曲松、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、林可霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、氨苄西林钠耐药。临床上应根据实际情况选取大肠杆菌敏感的药物以达到良好的治疗效果。并对猪场的管理进行评估，以寻找改善猪场环境卫生和饲养管理的方案以预防此类疾病再度发生。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病料。病死仔猪采集小肠肠道；存活腹泻仔猪，采集新鲜粪便；30份血样：1～24号采自母猪，25～30号采自保育仔猪，每份2～3mL，保鲜保存。

1.1.2 试剂。培养皿、接种环、恒温培养箱、显微镜、载玻片、伊红美蓝琼脂培养基（EMB培养基）、药敏纸片（丁胺卡那、环丙沙星、氨苄西林、头孢曲松、卡那霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、红霉素、阿奇霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑耐药等抗菌药敏纸片）、革兰氏染液、生理盐水。

1.1.3 相关设备。PCR仪、生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、酶标仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 抗体水平检测。将送检30份血样，离心提取血清，采用ELISA法分别检测其猪瘟抗体、猪伪狂犬gB抗体和gE抗体（野毒抗体）、蓝耳病毒抗体、圆环2型病毒抗体，并记录结果。其判断标准如下：

（1）猪瘟抗体（阻断ELISA法，美国IDEXX：99-43220-M301）判断标准：阻断率≥40%为合格（＋），阻断率≤30%为不合格（－），阻断率在30%～40%间为可疑（±）。

（2）猪伪狂犬（gB）总抗体（竞争ELISA法，美国IDEXX：09732-EP237）判断标准：S/N值≤0.6为阳性（＋），S/N值≥0.7为阴性（－），S/N值在0.6～0.7之间为可疑（±）。

（3）猪伪狂犬（gE）野毒抗体（竞争ELISA法，美国IDEXX：09836-HP871）判断标准：S/N值≤0.6为阳性（＋），S/N值＞0.7为阴性（－），S/N值在0.6～0.7之间为可疑（±）。

（4）蓝耳抗体（间接ELISA法，美国IDEXX：40959-L481）判断标准：S/P值≥0.4为阳性（＋），S/P值＜0.4为阴性（－）。

（5）猪圆环抗体（ELISA，深圳芬德：19007）判断标准：OD值≥0.38为阳性，OD值在0.2～0.38之间为可疑（±），OD值＜0.2为阴性。

1.2.2 仔猪粪便球虫检测。采集病猪肠道内容物及粪便，采用饱和盐水漂浮法，具体步骤如下：取5g猪肠道内容物及粪便放入盛有100mL生理盐水的烧杯中，用玻璃棒顺着同一个方向搅拌均匀后，用纱布过滤粪液到另一个烧杯中，弃去粪渣，水平静置过滤液30min左右，然后用0.5cm的金属圈水平接触液面，提起后将采集到的滤液涂抹于载玻片上，压上载玻片后镜检，并将镜检结果拍下记录。

1.2.3 细菌分离。采集病猪肠道，无菌操作剪开肠管，于无菌生理盐水中充分洗涤，用接种环刮取肠黏膜，划线接种于EMB培养基。将培养基置37℃恒温生化培养箱中培养24 h，观察结果。

1.2.4 分离菌染色镜检。取少量生理盐水滴于载玻片中央，接种环严格灭菌后冷却一段时间，挑取培养24 h后的EMB培养基上光滑、边缘整齐、黑色带金属光泽的单个菌落后，与载玻片上的生理盐水均匀混合涂布成适当大小的薄层。运用革兰氏染色法进行染色，其步骤如下：

(1)草酸铵结晶紫初染1min。

(2)将载玻片拿到水龙头下，用较缓水流洗去浮色。

(3)用碘-碘化钾溶液媒染1min，倾去多余溶液。

(4)乙醇(95%)脱色至无染液浮出为止。

(5)用沙黄复染30 s，倾去多余溶液。若是革兰氏阳性菌则呈现蓝色，若是革兰氏阴性菌则呈现红色。

1.2.5 药物敏感试验。采用药敏纸片扩散法，用接种环挑取EMB培养基上的单个菌落悬于3mL生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度与比浊管相同。用无菌棉拭子蘸取菌液，挤掉多余菌液均匀涂布于整个琼脂培养基表面，可反复操作至确认菌液全面均匀覆盖琼脂培养基。待培养基上的水分被琼脂充分吸收后，用无菌镊子夹起药敏试纸，贴在培养皿表面，试纸一旦接触到琼脂表面就不可再次夹起，每个培养基贴7张药敏纸片，各个纸片之间保持适当且一致的距离。将平板反转放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养24 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录结果。（判断标准见表1[5]

表1 药敏试验判断标准

1.2.6 仔猪流行性腹泻病毒基因检测。采集病仔猪肠、脾脏等病料，运用RT-PCR的检测方法，通过设计猪流行性腹泻病毒的特异性检测引物，提取病料中的总RNA，在50℃30min;95℃5 min;95℃40～60 s，55℃40～90 s，72℃1～5.5 min的条件下，循环35次;再在72℃的温度下延伸10 min，对提取到的基因组进行RT-PCR扩增，然后取出5μL扩增产物，加1μL 6×上样缓冲液，10 g/L琼脂糖凝胶、120 V电压45 min，电泳检测，通过紫外凝胶成像系统观察扩增片段[4]。

2 结果与分析

2.1 抗体水平检测结果。送检30份血样抗体水平检测结果见下表2。

检测结果显示：猪瘟抗体合格率93.33%、平均阻断率73.27%、离散度25.57%；伪狂总抗体合格率100%，伪狂野毒抗体阳性率为0，可疑6.67%；蓝耳抗体阳性率93.33%、离散度46.81%、其中有16头S/P值≥2.5；猪圆环抗体阳性率76.67%、离散度51.27%。

表2 血样抗体水平检测结果

说明：猪群猪瘟抗体水平较好；伪狂犬总抗体水平高、未检出伪狂野毒抗体，但有2头可疑；蓝耳病毒抗体水平高、整齐度一般；圆环2型病毒抗体一般。

2.2 仔猪粪便球虫检测结果

样品1（如图1）和样品2（图2）均未发现球虫等肠道寄生虫虫卵及卵囊，球虫检测阴性（-）。

图1、图2 粪便样品寄生虫检测结果

2.3 细菌分离鉴定结果

培养结果如图3和图4，可见EMB培养基上，有多量较单一的光滑型，黑色带金属光泽菌落。

菌落制备细菌涂片，干燥，染色，镜检为革兰氏阴性球杆菌（图5、图6），可疑大肠杆菌。

图3、图4 细菌分离结果

2.4 药物敏感试验结果

培养结果如图7。该分离细菌对丁胺卡那（阿米卡星）敏感，对环丙沙星中度敏感，对头孢曲松、卡那霉素、氨苄西林、新霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考、红霉素、阿奇霉素、林可霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑耐药。药敏试验结果见表3。

图5、图6 细菌染色镜检结果

图7 细菌药敏试验结果

表3 药敏试验结果判断 mm

2.5 病毒基因检测结果

送检2个样品，经RT-PCR扩增，均未扩增出特异性病毒基因片段（见图8），猪流行性腹泻病毒检测阴性（-）。

3 分析与讨论

肠产毒型大肠杆菌是引起猪场仔猪腹泻主要的病原微生物之一，常使仔猪发育迟缓，生产性能降低，严重的可导致死亡，给养殖场造成很大的经济损失。初生仔猪与早期断奶仔猪免疫系统尚未发育完全或断奶导致的免疫抑制等造成仔猪对大肠杆菌的敏感性增高，抵抗力下降，从而引发大肠杆菌性腹泻[6]。

3.1 关于病因的讨论

根据采集到的30份血样进行了抗原抗体检测，结果显示：猪群猪瘟抗体水平较好；伪狂犬总抗体水平高、未检出伪狂野毒抗体，但有2头可疑；蓝耳抗体水平高、整齐度一般；圆环病毒抗体一般。说明该猪场比较注重病毒性传染病的免疫，但是却忽视了猪群中细菌性传染病的预防。该猪场仔猪发病时间在三月，正值低温高湿的季节，若不采取猪场的保温措施，仔猪的自身抵抗力将下降，肠道内的致病性大肠杆菌往往会大量繁殖，引发大肠杆菌病[7]。

图8 病毒基因扩增结果

3.2 关于大肠杆菌的致病机理的讨论

肠产毒型大肠杆菌可通过口腔进入易感宿主小肠，其菌毛黏附素与小肠上皮细胞的微绒毛和细胞表面的受体相结合，从而在肠内定居繁殖，同时产生并释放肠毒素，对仔猪肠道内靶细胞产生毒性作用。其中不耐热肠毒素（LT)可活化胞内腺苷酸环化酶，导致cAMP浓度升高，耐热肠毒素（ST)可激活肠黏膜上皮细胞内的鸟苷酸环化酶，使胞内cGMP浓度升高，引起一系列级联激活反应，最终使Cl-和HCO3-大量分泌，而Na+的吸收受到抑制，肠内水和电解质大量蓄积而使渗透压升高，进而引起水样腹泻[8]。

3.3 关于治疗方面的讨论

根据实验室检测结果可以初步确定是大肠杆菌性腹泻，再结合药敏试验结果，应采取以下治疗措施。

3.3.1 打扫猪舍并消毒。清理猪舍中残留的粪便，并使用环境消毒剂对猪舍进行全面的消毒。保持猪体干燥洁净，必要时可用干燥消毒粉带猪消毒，给猪群营造卫生的生长环境。

3.3.2 抗生素治疗。轻度腹泻的仔猪可早晚按体重口服环丙沙星口服液，连用3d，观察治疗效果。重度腹泻仔猪肌肉早晚按体重注射阿米卡星，连用3d，观察治疗效果。

3.3.3 对症治疗。对脱水的仔猪采取补液治疗：轻度脱水可早晚按体重口服氨基酸维生素，在仔猪的饮水中添加补液盐，连用2～3d。中度脱水可早晚按体重在病猪腹腔猪舍10%葡萄糖生理盐水[9]。

3.4 关于预防方面的讨论。

致病性大肠杆菌除了可以通过粪便、被污染的饲料和饮水侵袭仔猪外，还可通过带菌母猪的胎盘和乳汁传染给仔猪，所以做好怀孕母猪的保健和环境消毒十分重要。应改善母猪的饲料质量，使母猪膘情良好。临产前一个月接种大肠杆菌k88、k99进行免疫[10]。在转入分娩舍前5天，母猪应做好清洁和全面消毒的工作。转入分娩舍后应清洗消毒栏舍，避免产房污染。母猪在生产时先用0.1%高锰酸钾溶液擦拭乳房、会阴等部位，同时挤去可能受到污染的乳汁3～4滴[8]，切断母猪将致病性大肠杆菌传给仔猪的途径。

在饲养管理方面，在仔猪出生后应保持栏舍中的卫生，定期消毒，并注意仔猪的保暖，防止仔猪因寒冷而导致自身免疫力下降。对断奶仔猪，要尽量减少诸如寒冷、环境、混群、运输等造成的应激。此外还需定期对猪群进行全面的检疫，淘汰、隔离患病猪，以控制不同血清型的大肠杆菌进入猪群。关注哺乳母猪的泌乳情况，定期抽检乳汁，对泌乳少的母猪，应增加其饲喂次数或改善饲料水平。淘汰因种用时间长而产弱仔、泌乳少的母猪。

在猪群免疫方面，应注意注射疫苗时杜绝多头猪共用一个针头注射的情况。初生仔猪需在出生后4 h之内饲喂初乳，增加其体内的抗体水平，增强其免疫力[11]。