生物炭对白浆土土壤微生物功能多样性的影响

2021-06-01陆欣春郑永照韩晓增邹文秀

土壤与作物 2021年2期

陆欣春，郑永照，韩晓增，陈旭，邹文秀，严君

(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨 150081；2.通化市农业科学研究院,吉林梅河口 135007)

0 引言

生物炭施用能够改变土壤物理化学属性，改变土壤微生物群落组成和丰度，减少温室气体释放，降低有毒元素对植物的侵害，提升土壤肥力和增加作物产量[1-4]。生物炭作为一种新型的土壤改良剂，因其独特的物理化学性质(高碱度、高比表面积、多孔隙结构和高灰分等)，被认为可能是未来改良酸性土壤的有效途径，也因此引起了国内外科研工作者的广泛关注[5]。

目前主要采用Biolog-Eco技术通过对碳源底物利用情况的分析，评价微生物群落功能多样性。然而，不同的生物炭类型、施用水平之间生物炭添加对土壤微生物群落功能的影响是不同的[6]。施用生物炭提高根际土壤微生物对糖类、氨基酸类和羧酸类碳源的利用能力，生物质炭≥40 t·hm-2塿土土壤微生物对氨基酸类、羧酸类的利用能力最强[7]。武爱莲等[8]通过在褐土上施用生物炭的研究表明，施用生物炭后改变了土壤微生物群落结构组成，降低了褐土土壤中的微生物活性，进而减少或改变了褐土土壤微生物对碳源的利用种类和强度。Zhu等[9]研究表明，我国北方地区农民为追求高产而过度施用化肥，不施用有机肥，使土壤无法分解肥害，致使土壤严重酸化(pH<4.0)，严重影响玉米产量。目前，关于生物炭对土壤改良、肥力提升以及土壤微生物群落结构方面已有很多报道[4,10-11]，而针对中国东北长期施化肥造成的酸化土壤中微生物群落功能对生物炭改良的反应的研究还较少。本研究选取了我国东北典型旱地白浆土土壤，以玉米秸秆生物炭为原料，采用不同施用量的生物炭改良酸化白浆土土壤，以明确其改良过程中生物炭施用对土壤微生物对碳源的代谢利用特征。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2018年4月在吉林省通化农科院梅河口海龙镇前进村试验田(42°36′N，125°53′E)进行，供试前土壤的有机碳含量15.1 g·kg-1，全氮含量1.42 g·kg-1，速效磷61.4 mg·kg-1，速效钾136.7 mg·kg-1，pH(水土比2.5∶1)为4.52。试验区地势平坦，属于温带大陆性季风气候，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥。年均气温4～6 ℃，年降水量600～750 mm，其中6～9月的降水量占全年降水的70%左右。试验区土壤类型为典型白浆土。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，设置了4个生物炭处理：生物炭添加量为0、15 t、30 t和60 t·hm-2处理，代码依次为C0t、C1t、C2t和C3t。每个处理3次重复，共12个小区，小区规格为3 m×10 m，各小区之间有两行的保护行。2018年5月3日田间试验开始前，将供试生物炭磨细过1 mm筛后，一次性撒施于表层土壤，深翻使之与耕层土壤充分混匀，之后不再施用生物炭。生物炭的基本理化性质：有机碳447.7 g·kg-1，全磷3.4 g·kg-1，全钾31.3 g·kg-1，pH(水土比2.5∶1)为7.89。

1.3 土样采集与分析

于2019年9月28日玉米成熟期前，采集0～20 cm土壤样品。每个小区内采集5个点的新鲜土壤样品，然后混合均匀后作为一个处理的样品。随后，将新鲜土壤样品迅速带回实验室，去除杂草、落叶及树枝等过2 mm筛混合均匀，放入无菌袋中，于4 ℃冰箱中保存，用于测定土壤的含水量及微生物的功能多样性。土壤微生物功能多样性采用Biolog-Eco测定[12]。

1.4 数据统计分析

碳源利用的强度、多样性和优势度指数分别采用反应孔颜色的平均变化率(Average well color development，AWCD)、Richness丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数和Simpson优势度指数来评估，具体的计算公式参照Keylock和Strong的方法[13-14]。采用Microsoft Excel 2019、SPSS 20.0整理分析试验结果，采用Origin 9.0绘制图形。

2 结果分析

2.1 生物炭添加对土壤微生物利用碳源的动力学特征的影响

随着培养时间的延长，不同处理下土壤微生物利用碳源代谢活性的AWCD逐渐增加，呈S型曲线(图1)。培养24 h内，各处理间AWCD值无明显变化，24 h～48 h之间C0t和C1t处理AWCD值无显著变化，C2t和C3t处理AWCD值开始快速增长，且与C0t和C1t处理差异显著；48 h～168 h之间C1t、C2t和C3t处理AWCD值呈现快速增长的趋势，此时土壤微生物对碳源的综合利用能力最强。168 h后AWCD值增长趋于平缓，微生物对碳源的利用能力逐渐减弱。因此，采用不同生物炭量处理168 h时的AWCD值进行土壤微生物碳源代谢活性的进一步分析。

图1 不同量生物炭处理下土壤微生物碳源平均利用率的变化Fig.1 AWCD of microorganisms under different biochar application rates

不同处理土壤培养192 h内，土壤微生物AWCD值的整体变化表现为C3t>C2t>C1t>C0t(P<0.05)。培养168 h时，C3t、C2t和C1t处理较C0t处理AWCD值分别增加了29.7%、22.9%和21.2%，其中当生物炭添加量为60 t·hm-2时，土壤微生物的AWCD值最高达到1.17。原始土壤样品添加生物炭后，土壤微生物代谢活性发生显著变化，表明添加生物炭有助于土壤微生物代谢活性及其对碳源利用能力的提高。

2.2 生物炭添加对土壤微生物功能多样性指数的影响

表1是土壤培养168 h时的吸光值，土壤微生物功能多样性指数的计算。随着生物炭添加量的增加，土壤丰富度指数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数均显著增加(P<0.05)，表现为：C3t>C2t>C1t>C0t。C0t处理的土壤丰富度指数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数显著低于添加生物炭处理(C1t、C2t和C3t处理)。生物炭添加量为15 t·hm-2时，土壤微生物对碳源利用的丰富度指数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数显著增加，当生物炭添加量达到60 t·hm-2时，各指数均达到最高。

表1 不同生物炭添加量对土壤微生物功能多样性指数的影响Table 1 Functional diversity indexes of microorganisms under different biochar application rates

2.3 生物炭添加对碳源利用多样性的主成分分析

对不同生物炭添加处理下168 h的土壤微生物碳源代谢进行主成分分析，可了解不同生物炭处理后土壤微生物群落功能的综合差异和相似状况。图2可知，4个处理在31种碳源构建的主成分分析中存在明显的空间分异，整体可分为C0t、C1t、C2t和C3t三大类。C0t、C1t分别在第三和第一象限中分布，C2t和C3t相聚较近均分布在第四象限中。主成分方差分析可知，不同生物炭量添加处理在PC1和PC2轴上的得分系数差异显著(表2)，在PC1轴上，C0t、C1t、C2t、C3t处理之间差异显著；在PC2轴上，C0t、C1t处理与C2t和C3t处理之间差异显著，C2t和C3t处理间差异不显著，表明C2t和C3t处理的碳源代谢功能特征相似。进一步对PC1和PC2贡献的特征向量系数大于0.5的碳源类型进行分析表明，对PC1贡献大的碳源有30种，其中碳水化合物类有11种，占碳源总数的35.5%；对PC2贡献大的碳源有4种，主要是碳水化合物类(9.7%)和胺类(6.5%)。

图2 不同生物炭处理下土壤微生物碳源代谢主成分分析Fig.2 Principal component analysis on the functional diversity of microorganisms under different biochar application rates

表2 不同生物炭施用量处理主成分得分系数Table 2 Principal component scores under different biochar application rates(mean±SD)

2.4 土壤微生物生理碳代谢指纹图谱分析

土壤微生物Biolog代谢指纹图谱，能够较为全面的反映微生物群落代谢功能特征。由图3可知(以培养168 h数据为例)，不同生物炭添加量处理土壤微生物群落对碳源利用率存在差异。C0t处理对多聚物类利用最高，达到40.5%，其次是碳水化合物类(32.8%)；而C1t、C2t和C3t处理则对碳水化合物类(29.3%～34.9%)、氨基酸类(22.0%～25.2%)的利用最高。土壤微生物群落对碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、酚酸类和胺类碳源的利用强度整体表现为：C3t>C2t>C1t>C0t。随着生物炭施用量的增加，土壤微生物碳源利用种类逐渐增多，且表现为由多聚物类向氨基酸类和羧酸类碳源转变的趋势，表明生物炭施用改变了土壤中微生物对碳源的利用。

注：A2-H2：碳水化合物类；A4-F4：氨基酸类；B1-H3：羧酸类；C1-F1：多聚物类；C3和D3：酚酸类；G4和H4：胺类。Note:A2-H2:Carbohydrates; A4-F4:Amino acids; B1-H3:Carboxylic acids:C1-F1:Polymer; C3 and D3:Phenolic acids; G4 and H4:Amine.图3 不同生物炭处理下土壤微生物生理碳代谢指纹图谱Fig.3 Metabolic fingerprint of carbon physiological profiles of soil microbial community under different biochar application rates

不同生物炭添加量处理下，C3t处理对碳源的利用种类和强度最高。C0t处理可利用的碳源仅有9种(且吸光值均≤0.2)，占碳源总数的29.0%，其中对D-木糖(碳水化合物类)、吐温-40(多聚物类)和吐温-80(多聚物类)的利用最高，这三种碳源在添加生物炭后的利用能力显著减弱。C1t处理可利用的碳源(土壤代谢指纹图谱中吸光值≥ 0.8)有17种，占碳源总数的54.8%，其中对L-苯基丙氨酸(氨基酸类)、D-半乳糖醛酸(碳水化合物类)和D-甘露醇(碳水化合物类)的利用最高，且对L-苯基丙氨酸利用显著高于其它处理(P<0.05)。C2t处理可利用的碳源有20种，占碳源总数的64.5%，其中对吐温-80(多聚物类)、L-苯基丙氨酸(氨基酸类)和L-天冬酰胺酸(氨基酸类)的利用最高；C3t处理可利用的碳源有24种，占总碳源的77.4%，其中对L-天冬酰胺(氨基酸类)、L-精氨酸(氨基酸类)和苯乙基胺(胺类)的利用率最高，且对这三种碳源的利用显著高于其它处理(P<0.05)。C0t对照处理土壤代谢指纹图谱中吸光值 ≥ 0.8的碳源没有，增施生物炭处理土壤微生物对碳源的利用能力显著高于对照C0t处理，其中增施生物炭处理土壤微生物对D-木糖、D-半乳糖醛酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-苏氨酸、吐温-40、吐温80、肝糖和腐胺的利用能力显著高于C0t处理。C0t处理土壤微生物活性极其弱，但随着生物炭的添加，C0t处理不能利用22种碳源的利用强度和种类逐渐增多，其中苯乙基胺(胺类)和D,L-α-甘油(碳水化合物类)在生物炭添加到30 t·hm-2时，为土壤微生物利用；而葡萄糖-1-磷酸盐(碳水化合物类)和2-羟苯甲酸(酚酸类)则需要生物炭添加到60 t·hm-2时，为土壤微生物利用。

3 讨论

Biolog-Eco技术通过对碳源利用的吸光值变化来表征土壤微生物活性，其值越高表明土壤微生物群落的代谢活性越强[15]。施用有机质和生物炭有利于土壤微生物群落和活性的增加[16-17]。本研究中，随着生物炭施加量的增加，AWCD、多样性指数、丰富度指数和Simpson指数亦增加，均显著的高于C0t处理，表明增施生物炭可显著提高酸性土壤微生物碳源利用的能力、强度和群落功能多样性。这主要是由于生物炭施用后土壤pH和C/N显著提升，土壤容重下降，土壤孔隙度增加，为土壤微生物的生长和繁殖营造了良好的生存环境条件[18-19]。此外，生物炭添加还会引起植物根系分泌吲哚乙酸(IAA)增加，植物防御系统激活等，这些均会造成土壤微生物活性和多样性增加[20-22]。Zhu等[9]研究表明，随着生物炭量的增加，AWCD值呈下降的变化趋势，且对多样性指数、均匀度指数和Simpson指数没有影响，这是由于土壤中缺少可利用的底物[23]，或是土壤中微生物群落结构稳定[24]。有研究表明，在白浆土、潮土、灰漠土和棕壤土上施用玉米芯生物炭，试验前期未添加生物炭处理的AWCD以及多样性指标均高于添加生物炭处理[10]。在肥力较高、土壤属性优于白浆土的黑土耕地上的研究表明，低质量分数外源生物炭的添加可以促进黑土土壤微生物代谢活性增加，而高浓度生物炭的添加则抑制土壤微生物的代谢活性[25]。不同试验产生的结论不同，主要与试验所用生物炭的原料及生产工艺不同从而使生物炭的理化性质不同有关，主要体现在全碳含量及生物炭的pH值上，此外与土壤本身的质地和酸碱度有关；另一方面与作物根系活力及生育时期有关，作物将40%以上光合固定的碳源以根系分泌物等形式释放到土壤环境中，因此根系活动及与微生物的相互作用最为密切，是直接导致土壤微生物群落结构变化的因素[26]。

主成分分析结果表明，不同生物炭量添加处理在PC1和PC2轴上的得分系数差异显著，C0t处理和C1t、C2t、C3t处理对第一主成分(PC1)相关碳源的利用率较大；C1t、C2t和C3t处理对第二主成分(PC2)相关的碳源的利用率较大。PC1和PC2得分系数与31种碳源吸光值相关系数，相关系数越大表明该碳源主成分的影响越大[27]。朱珂等[28]在白浆土玉米不同生育时期根际细菌群落代谢特征的研究表明，根际细菌群落主要利用的碳源是碳水化合物类和氨基酸类，占碳源利用的55%以上。而本研究中白浆土在添加生物炭后土壤微生物主要利用碳水化合物类和胺类。碳代谢指纹图谱结果表明，C0t处理的碳代谢能力最低，增施生物炭后土壤微生物对吐温80、D-木糖、D-半乳糖醛酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、肝糖、L-苏氨酸、吐温-40和腐胺的利用能力增强且显著高于C0t处理，表明增施生物炭改变了土壤微生物群落组成，进而影响了对某些碳源的代谢。生物炭添加量不同对土壤微生物利用糖类、氨基酸类、羧酸类、聚合物类碳源的微生物的代谢活性和多样性的影响不同。这可能是由于增施生物炭后引起植物残体和根系分泌物增多，为土壤微生物存活提供了大量可利用的碳水化合物类、氨基酸类等能源物质，进而引起土壤微生物活性和碳源代谢能力增强[29]。

C2t和C3t处理的丰富度指数、Shannon-wiener指数和Simpson指数较为接近，两者对六类碳源的利用能力也类似。分析其原因可能是该处理土壤微生物对碳源的利用能力有限，从而导致土壤微生物的丰富度增加不明显。因此，应根据实际生产以及对土壤微生态环境的影响需要适量添加生物炭。土壤微生物功能多样性可作为评价土壤质量变化的敏感指标。Biolog代谢指纹图谱能够较为全面快速反映微生物群落碳源代谢活性和功能差异，但无法明确具体产生这种差异的微生物来源。今后的研究中，在分析微生物群落功能差异的同时，还应该综合宏基因组、转录组和代谢组学等分子生物学方法，分析生物炭施用量对土壤微生物多样性、土壤环境因子以及根系分泌物之间的关系，这样才能全面揭示生物炭添加对土壤微生物群落功能影响的生态学过程和发生显著变化的内在机制，从而为指导生产提供更可靠详实的理论依据。