PEG-Asp对Ph阴性成人急性淋巴细胞白血病患者临床疗效及Notch1、ASB2基因表达的影响

聂盼盼，李倩娟，陈晨晨

（1.河南科技大学第一附属医院血液科，河南 洛阳 471000；2.河南科技大学第一附属医院肾内科，河南 洛阳 471000）

急性淋巴细胞白血病属于淋巴造血恶性肿瘤疾病的一种，其起源于B造血祖细胞和T造血祖细胞，根据2012年全国肿瘤登记中心报道[1]，目前，恶性淋巴肿瘤发病率为5.1/10万，在所有恶性肿瘤中顺位第8位。临床上，治疗急性淋巴细胞白血病的主要药物包括三种：来自于大肠埃希菌的左旋门冬酰胺酶（L-asparaginase, L-Asp），来自于欧文菌的L-Asp，以及来自于大肠埃希菌的聚乙二醇化门冬酰胺酶（PEG-Asp）[2]。源于欧文菌的L-Asp的短效性，临床限制了其的使用，而来自大肠埃希菌的L-Asp属于异源性蛋白，其在临床使用中常出现严重过敏反应，所以临床使用较为限制。而PEG-Asp是我国自主研发的新型门冬酰胺酶制剂，在制作工艺中，对L-Asp的免疫原性进行大幅降低，同时对其药理活性进行了大规模保留，临床疗效中效果良好[3]。研究[4]显示，跨膜转运蛋白（Notch1）信号参与了淋巴细胞成熟的多个阶段，其信号的表达与急性淋巴细胞白血病的形成密切相关。细胞信号抑制因子盒蛋白2（ankyrin-repeat SOCS box contain protein, ASB2）信号通路与蛋白泛素化作用有关，参与了急性淋巴细胞白血病的形成。本文采用PEGAsp治疗Ph阴性成人急性淋巴细胞白血病，探究其临床疗效及对Notch1、ASB2基因表达的影响，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为本院2016年2月—2019年2月住院的Ph阴性成人急性淋巴细胞白血病患者60例，年龄集中在40～55 岁，平均年龄(49.12±1.78)岁，男性患者35 例，女性患者25 例，文化程度：小学及以下13 例，中学学历18 例，大专学历及以上29 例，婚姻状态：已婚55 例，未婚5 例，急性淋巴细胞白血病风险分层：标危11 例，高危49 例。所有患者均签署知情同意书，并获得医院伦理学术委员会论证通过。利用随机数字表，将患者分为观察组和对照组，每组30 例，两组患者一般资料之间的差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（表1）

表1 两组患者基线资料对比（例）

1.2 患者入选标准 纳入标准：①所有患者均符合Ph阴性成人急性淋巴细胞白血病诊断标准[5]；②年龄均在14 岁以上；③所有患者均为首次治疗。排除标准：①其他血液系统疾病；②无法沟通的患者；③伴有高血压、糖尿病以及肿瘤史患者；④意识不清患者。

1.3 研究方法 观察组患者使用VDPAP化疗方案治疗，注射用硫酸长春地辛（山东罗欣药业集团股份有限公司，国药准字H20053020，4 mg/d，d1、8、15、21）；注射用盐酸柔红霉素（深圳万乐，国药准字H44024361，30 mg/m2，d1-3，d15-16），PEG-Asp（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090015，2 500 IU/m2，d8、22），PEG-Asp使用过程中分为三个部位进行肌肉注射。环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32026196，750 mg/m2，d1、15）。地塞米松（辰欣药业股份有限公司，国药准字H37021969，10 mg/d，d1-14，5 mg/d，d15-28），28 d为1 个疗程，治疗2 个疗程。对照组患者也使用VDPAP化疗方案治疗，将化疗方案中的PEG-Asp使用L-Asp（北京双鹭药业股份有限公司，国药准字H20065348，6 000 U/m2）进行代替，d11、14、17、20、23、26，28 d为1 个疗程，治疗2 个疗程。其后均采用相同的巩固维持方案。

1.4 观察指标

1.4.1 两组患者治疗前后骨髓象和血象对比观察：分别对两组患者治疗前和治疗2 个疗程后进行骨髓象和血象检查，观察两组患者的骨髓幼稚细胞比例、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、白蛋白含量（ALB）以及血红蛋白含量（Hb）之间的差异。

1.4.2 两组患者近期效果评价：效果评价标准[6]：使用《血液病诊断与疗效标准》对患者的近期效果进行评价。患者骨髓：原始淋巴细胞＋幼淋巴细胞≤5%，红细胞及巨核细胞系正常，患者外周血：血红蛋白：男性≥100 g/L，女性及儿童≥90 g/L；中性粒细胞绝对值≥1.5 ×109/L；血小板≥100 ×109/L；外周血白细胞分类中无白血病细胞，临床无白血病细胞浸润所致的症状和体征，生活正常或接近正常则为完全缓解（CR）。患者骨髓：5%＜原始淋巴细胞＋幼淋巴细胞≤20%，或临床、血象中有1项未达完全缓解标准者则为部分缓解（PR）。患者骨髓原始淋巴细胞＋幼淋巴细胞＞20%，临床、血象均未见明显改善则为未缓解（NR）。总有效率＝(PR＋CR)/总例数×100%。

1.4.3 两组患者远期疗效对比：分别对两组患者治疗结束后随访1 年，观察两组患者的无进展生存期（PFS）以及生存期（OS）之间的差异。其中PFS以患者出现骨髓复发、骨髓外复发以及死亡为结局事件。

1.4.4 两组患者Notch1 mRNA、ASB2 mRNA的表达情况对比：分别于治疗前和治疗2 个疗程后，抽取患者5 mL骨髓，使用淋巴细胞分离液获得单个核细胞，使用总RNA提取液1 mL混匀后，－80 ℃冷冻保存待检。患者Notch1 mRNA、ASB2 mRNA的表达情况采用Western blotting方法进行，对上述细胞进行扩增后，分别使用方正扫描仪对患者以上电泳结果进行扫描，同时以Quantity One软件对患者的电泳结果进行灰度计算，以患者Notch1、ASB2与GAPDH条带的相对吸光度值对患者的Notch1、ASB2水平进行评估。基因扩增采用real-time PCR扩增技术，Notch1上游引物为5' CGACGCACAAGGTCTGTCTTCCA 3'，下游引物为5' CGGACTTGCCCAGGTCATCTAC3'，179 bp，ASB2上游引物为5'CGTGGTGCAGTT CTGTGAGT 3'，下游引物为5' GTGAGCC AGAGGTCTTGGAC 3'，186 bp。采用GREEN QPCR Mix试剂盒进行扩增，基因的相对表达量以2-ΔΔct表示。

1.4.5 两组患者不良反应对比：分别对两组患者治疗过程中可能出现的过敏反应、肝功能损害、胃肠道反应、活化部分凝血活酶时间（APTT）延长等不良反应进行对比。

1.5 统计学分析 文中数据均采用SPSS 22.0软件进行汇总分析。其中计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以[例(%)]表示，采用卡方检验。当P＜0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后骨髓象和血象对比观察 两组患者治疗前骨髓幼稚细胞百分比、WBC、PLT、ALB以及Hb之间的差异无统计学意义（P＞0.05），且治疗后，观察组患者的骨髓幼稚细胞百分比、PLT、Hb、APTT均明显高于对照组，观察组患者WBC明显低于对照组（P＜0.05）。（表2）

表2 两组患者治疗前后骨髓象和血象对比观察（±s，n＝30）

表2 两组患者治疗前后骨髓象和血象对比观察（±s，n＝30）

指标 治疗前 t P 治疗后 t P对照组 观察组 对照组 观察组骨髓幼稚细胞百分比（%） 67.67±19.11 71.38±21.09 1.010 0.315 7.14±0.85 7.58±0.12 3.970 0.000 WBC（×109/L） 15.67±2.13 15.57±2.43 0.240 0.811 6.32±1.43 4.25±1.39 8.040 0.000 PLT（×109/L） 103.24±21.32 107.65±23.54 1.076 0.284 217.83±11.94 239.78±12.32 9.910 0.000 ALB（g/L） 37.12±19.17 37.43±17.91 0.092 0.927 38.24±17.09 39.24±17.89 0.313 0.755 Hb（g/L） 81.32±11.54 74.87±12.78 1.102 0.273 109.67±14.22 120.34±15.33 3.953 0.000 APTT（s） 34.23±1.56 34.54±1.78 1.015 0.312 36.32±1.09 37.67±1.22 6.392 0.000

2.2 两组患者近期疗效对比 通过6 个月的治疗，观察组患者的总有效率为90.00%，对照组患者的总有效率为75.00%，两组患者疗效之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 两组患者疗效对比[例(%)]

2.3 两组患者远期疗效对比 通过对患者的1 年随访，两组患者均未发现失访，且观察组患者的PFS和OS均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

表4 两组患者远期疗效对比[例(%)]

2.4 两组化疗前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平比较 治疗前，两组患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平之间的差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后，两组患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平均有明显下降，且观察组患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平明显低于对照组（P＜0.05）。（表5）

表5 两组化疗前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平比较（±s，n＝30）

表5 两组化疗前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平比较（±s，n＝30）

分组 Notch1 mRNA t P ASB2 mRNA t P化疗前 化疗后 化疗前 化疗后观察组 15.34±2.31 2.34±1.33 37.778 0.000 9.24±2.87 1.87±2.34 15.416 0.000对照组 15.22±2.11 11.35±1.21 12.324 0.000 9.09±2.76 5.36±2.43 7.857 0.000 t 0.297 38.815 0.292 8.013 P 0.767 0.000 0.771 0.000

2.5 两组患者不良反应对比 通过治疗，观察组患者发生不良反应：肝功能异常、过敏反应、胃肠道反应以及APTT延长明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表6）

表6 两组患者不良反应对比[例(%)]

3 讨论

急性淋巴细胞白血病好发于儿童，成人也多见。成人急性淋巴细胞白血病占该病的20%～25%，由于其疾病的早发阶段外周血原始幼稚细胞较多，极易造成患者的神经系统白血病，预后较差[8]。

急性淋巴细胞白血病细胞的生长主要依赖于门冬酰胺，相比于正常人群，患者的门冬酰胺酶的活性较低，甚至无活性，必须依赖血浆合成，通过其分解作用，将血浆中的门冬酰胺分解为门冬氨酸，进而达到抑制患者的急性淋巴细胞白血病的形成，进而造成肿瘤细胞的凋亡。目前，L-Asp和PEGAsp是较为常用的急性淋巴细胞白血病的一线化疗药物，显著改善恶性淋巴瘤的生存率。本文研究结果显示，观察组患者的有效率明显高于对照组，从患者的远期疗效分析，观察组患者的生存情况明显优于对照组。分析认为，相比L-Asp，PEG-Asp具有较长的半衰期(7±2)d[9]，临床上只需一次给药。同时PEG-Asp在到达肿瘤细胞前始终保持脂类状态，避免在药物到达靶器官之前被细胞分解，提高了药物使用率，进而增加疗效[10]。梁家宝等[11]在对两种门冬酰胺酶进行治疗成人急性淋巴细胞白血病的研究中也提到，PEG-Asp效果显著，其安全性较好，与本文研究结果相互印证。

Notch1信号通路参与B淋巴细胞的生成，在Th2细胞中也有微调作用，早期研究发现Notch1信号通路参与白血病的分化和发展，并且已经有研究证实Noch1在B淋巴细胞急性淋巴细胞白血病和T淋巴细胞急性淋巴细胞白血病患者的单个核细胞中表达升高，可以作为新型药物治疗靶标，同时还有研究发现Notch1参与泛素化[12]，激活编码ASB2蛋白转录，且其基因表达与ASB2基因表达呈正相关性。本文研究结果显示，经过治疗后，观察组患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表达水平明显低于对照组，分析认为PEG-Asp通过抑制肿瘤细胞增殖，抑制其生长，提高了近期有效率，抑制了Notch1 mRNA和ASB2 mRNA的表达。Notch1是一个膜受体蛋白，与天冬氨酸酶催化亚基的活性相关，其含量的增高可能与肿瘤细胞的浸润相关，而ABS2的表达有研究显示，其与患者的Notch1表达呈现正相关，通过一系列的信号转录，进而对患者的泛素化反应进行调节。陈将华等[13]在对HERV-K Np9基因转录诱导人急性T淋巴细胞白血病的研究中发现，通过对患者体内门冬酰胺酶的抑制作用，有效抑制相关基因的转录，进而对其后续通路表达进行有效抑制，进而达到治疗效果，本文研究结果从侧面反映了门冬酰胺酶制剂对急性淋巴细胞白血病治疗的后续通路表达[14]，与文献研究相互呼应。

从安全性分析，观察组患者的不良反应发生率明显低于对照组，分析认为，L-Asp作为异源性蛋白，其半衰期相对较短，使用频次较多，而PEGAsp去除大量的免疫原性，同时保留药物作用，其对人体的安全性较好。

综上所述，PEG-Asp对Ph阴性成人急性淋巴细胞白血病患者的近期疗效和远期疗效较好，同时通过对Notch1、ASB2基因表达通路的影响，抑制患者的门冬酰胺酶作用，降低患者肿瘤细胞的浸润和增殖，同时，其安全性较好，值得在临床工作中推广。