基于七叶一枝花中高含量皂苷类成分的氮、磷、钾配施方案研究

2021-05-27威则日沙兰建龙赵雪莲海来约布张绍山杨正明

中草药 2021年10期

关键词：重楼磷肥钾肥

威则日沙，刘哲，兰建龙，赵雪莲，海来约布，张绍山，杨正明*，刘圆

1.西南民族大学药学院，四川成都 610041

2.西南民族大学青藏高原研究院，四川成都 610041

3.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川成都 610225

4.青藏高原民族药用资源保护与利用国家民委重点实验室，四川成都 610225

5.西南民族大学民族医药研究院，四川成都 610041

七叶一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.为百合科重楼属植物，是历版《中国药典》收载的2种基原药材“重楼”的来源之一，以重楼皂苷I、重楼皂苷II和重楼皂苷VII总含量为其质量评价指标[1]。重楼甾体皂苷是重楼中含有的主要活性成分，具有抗肿瘤、消炎、止血、抗菌、镇痛、镇静、抗氧化、免疫调节、抑制血管生成、保护肝脏与肾脏作用[2-3]。重楼是珍稀濒危名贵传统药材，过度采挖已使其野生资源濒临灭绝，人工栽培是解决滇重楼资源危机的必然途径。

近十多年来，重楼种植已成规模，种植面积不断扩大，肥料施用不均衡会导致重楼根茎品质下降[4]，探讨氮、磷、钾肥配施对七叶一枝花的质量的影响，可以为七叶一枝花的生态种植提供科学依据。目前，关于氮、磷、钾配施对重楼活性成分影响的研究主要以滇重楼为主，相关研究[5-9]结果表明，合理施用氮、磷、钾肥可提高滇重楼的产量和品质，土壤肥力是影响滇重楼质量的重要因素。不同植物对氮、钾、磷的需求比例不同，单一微肥量过高或过低对药材植物生长发育、药效成分的积累及药材质控标准均有影响，并且元素量单一化容易使土壤恶化[4-6,10]，因此适宜的氮、磷、钾肥配施是药用植物高产优质的重要基础。本实验采用3因素5水平二次回归通用旋转组合设计方法，采用UPLC-ELSD法测定20个小区的七叶一枝花中重楼皂苷I等7种甾体皂苷含量，探讨氮、磷、钾配施对七叶一枝花中皂苷类成分含量的影响，以期为规范化七叶一枝花的生态栽培提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC®超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；METTLER AE240电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-5200E型超声波清洗器（40 kHz、250 W，昆山超声仪器有限公司）；ProElut C18反相硅胶键合固相萃取柱（200 μg，北京迪科马科技有限公司）。

重楼皂苷I（批号MUST-19053105）、重楼皂苷II（批号MUST-18103104）、重楼皂苷V（批号MUST-19052102）、重楼皂苷VI（批号MUST-180717002）、重楼皂苷VII（批号MUST-18062201）、重楼皂苷H（批号MUST-19040101）、纤细薯蓣皂苷（批号MUST-15081110）均购自成都曼斯特生物有限公司，质量分数大于98%。乙腈为色谱纯（美国Sigma公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂为分析纯。

1.2 材料

以四川省汶川县水磨镇白石村西南民族大学重楼仿野生繁育试验基地人工栽种七叶一枝花为试验材料，经西南民族大学刘圆教授鉴定为百合科（Liliaceae）重楼属ParisL.植物七叶一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.，洗净，50 ℃烘干，粉碎，过筛（3号筛），备用。

供施肥料为尿素（总氮≥46.4%，四川宏泰生化有限公司公司）、过磷酸钙（P2O5≥12%，四川省成都市青白江区磷肥厂）、硫酸钾（K2O≥60%，国投新疆罗布泊钾盐有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 田间试验设计

田间试验设计见课题组前期报道[11]，试验地位于四川省汶川县水磨镇白石村西南民族大学重楼仿野生繁育试验基地。试验地土壤肥力状况：pH值为7.50；有机质为32.36 mg/kg；碱解氮为158.67 mg/kg；速效磷为51.67 mg/kg；速效钾为236.71 mg/kg。试验因素为氮肥（X1）、磷肥（X2）、钾肥（X3），采用3因素5水平二次通用旋转组合设计方法，共20个处理，20个小区随机安排于试验地中（试验小区面积为16 m2）。试验因素和水平编码见表1。二次通用旋转组合设计与试验方案见表2。

表1 因素水平编码Table 1 Code of factor levels

表2 试验设计与实施方案Table 2 Experimental design and implementation of programs

2.2 七叶一枝花中7种皂苷含量测定

2.2.1 色谱条件参照张绍山等[12]、刘哲等[13]重楼皂苷含量测定方法，已优化分离条件。ACQUITY UPLC®HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；分析时间23 min；进样量2 µL；ELSD检测器：增益500，冷却模式，漂移管温度55 ℃，氮气压力276 kPa；柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱程序：0～23 min，10%～80%A。混合对照品和供试品溶液色谱图见图1。

图1 混合对照品 (A) 和供试品溶液 (B) 溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed reference (A) and sample (B)

2.2.2 对照品溶液制备取重楼皂苷VII、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷II、重楼皂苷V、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I，精密称定，色谱甲醇定容到10 mL量瓶中，分别得0.522 0、0.320 0、0.526 0、0.442 0、0.460 0、0.163 0、0.476 0 mg/mL对照品溶液，用时以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

2.2.3 供试品溶液制备参考张绍山等[12]、刘哲等[13]的研究，取0.5 g七叶一枝花样品粉末，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL甲醇，摇匀，静置4 h，再超声30 min，滤过，重复上述操作1次。合并2次滤液，45 ℃减压旋蒸回收溶剂，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL，以0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.2.4 线性关系考察精密吸取对照品溶液适量，稀释到5 mL，配制成不同稀释倍数的混合对照品溶液，进样2 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制外标法标准曲线，结果见表3。

表3 对照品的线性回归方程Table 3 Linear regression equation of reference

2.2.5 样品测定取七叶一枝花样品粉末，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，以“2.2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，外标法计算含量。20个小区七叶一枝花样品的7个甾体皂苷含量见表4。

2.3 氮、磷、钾配施对七叶一枝花的皂苷类成分的影响

2.3.1 数学模型建立根据表4试验结果，利用DPS 7.05数据处理系统对数据进行回归模型分析，结合矩阵模型，建立氮肥（X1）、磷肥（X2）、钾肥（X3）与重楼皂苷VII含量的回归数学模型Y1、重楼皂苷VI含量的回归数学模型Y2、重楼皂苷H含量的回归数学模型Y3、重楼皂苷II含量的回归数学模型Y4、纤细薯蓣皂苷含量的回归数学模型Y5、重楼皂苷I含量的回归数学模型Y6、重楼皂苷V含量的回归数学模型Y7。用F检验法分别检验方程各项回归系数、方程总回归系数和失拟度，得到方差分析结果见表5。

表4 样品中7种皂苷含量Table 4 Contents of seven saponins

表5 氮、磷、钾肥与皂苷的方差分析Table 5 Analysis of variance of NPK fertilizer and saponins

通过方差分析所得方程经F检验，F1R＝35.991 93，F1Lf＝0.510 26，即FR显著，FLf不显著，说明二次回归方程拟合得较好，其可靠程度较高。其中一次项X1、X2、X3均达到显著，二次项X12、X22、X32达到显著水平，交互项均未达到显著；F2R＝17.574 89，F2Lf＝1.970 45，即FR显著，FLf不显著，说明二次回归方程拟合得较好，其可靠程度较高。其中一次项X1、X2、X3均达到显著，二次项X22、X32达到显著水平，交互项中X1X2达到显著；其余所得方程经F检验，FR不显著，FLf显著，说明二次回归方程拟合不好，不能说明氮肥、磷肥、钾肥对其他皂苷有影响。经上述检验，在α=0.05显著水平剔除不显著项后，得到简化后的回归方程：

2.3.2 因子主效应分析根据表5中各项回归系数的F值计算各因素对因变量的贡献率[14]，可得各因素对试验结果的影响效果，得到各因素对7种重楼皂苷的贡献率见表6。氮、磷、钾对7种重楼皂苷的贡献率影响不同（表6）。按贡献率从大到小排列得到各因素对重楼皂苷VII的影响为钾＞氮＞磷，对重楼皂苷VI的影响为钾＞磷＞氮，对重楼皂苷H的影响为磷＞氮，对重楼皂苷II的影响氮＞磷、钾，对纤细薯蓣皂苷的影响为磷>氮、钾，对重楼皂苷I的影响为钾＞氮＞磷，对重楼皂苷V的影响为氮＞磷＞钾。以上可以看出，氮、磷、钾对不同重楼皂苷含量的影响效果不同，说明氮、磷、钾配施可能对重楼皂苷的合成有影响。

表6 单因素贡献率Table 6 Single factor contribution rate

2.3.3 单因素效应分析通过降维处理，将磷、钾肥2个因素固定在0水平，可得出单因素氮肥与（1）方程中重楼皂苷VII的影响方程：

同理可得磷肥、钾肥与重楼皂苷VII之间的影响方程：

同上方法，将（2）方程进行降维处理可得出单因素对重楼皂苷VI的影响方程：

根据方程10～12得出Y1（重楼皂苷VII）单因素回归方程效应影响图，见图2。

图2 重楼皂苷VII单因素效应分析Fig.2 Polyphyllin VII single factor analysis

图2可以看出，氮肥、磷肥、钾肥对重楼皂苷VII影响整体呈上升的趋势。在−1.681 8～0水平，各因素对重楼皂苷VII的影响顺序为磷肥＞氮肥＞钾肥；0～1.681 8水平，各因素对重楼皂苷VII的影响顺序为钾肥＞氮肥＞磷肥。在−1.681 8～1.681 8水平，氮肥、磷肥、钾肥呈上升状态，表明随着肥力水平的增加重楼皂苷VII随之增加。在设计的5个水平中过低、过高都会影响重楼皂苷VII的增加，氮肥、磷肥、钾肥在1.681 8水平的氮、磷、钾配施能显著提高重楼皂苷VII。

根据公式方程13～15得出Y2（重楼皂苷VI）回归方程效应影响图，见图3。

图3 重楼皂苷VI单因素效应分析Fig.3 Polyphyllin VI single factor analysis

由图3可见，氮肥、磷肥、钾肥对重楼皂苷VI影响整体呈上升的趋势，各因素对重楼皂苷VI的影响顺序为钾肥＞磷肥＞氮肥。在−1.681 8～−1水平之间，磷肥、钾肥呈下降状态，表明随着肥力水平的增加重楼皂苷VI随之减小。在−1～1.681 8水平之间，氮肥、磷肥、钾肥呈上升状态，表明随着肥力水平的增加重楼皂苷VI随之增加。在设计的5个水平中过低、过高都会影响重楼皂苷VI的增加，氮肥、磷肥、钾肥在1.681 8水平的氮、磷、钾配施能显著提高重楼皂苷VI。

2.3.4 互作效应分析试验各因素之间不仅单独对试验结果产生影响，还存在互作效应。X1X2对重楼皂苷VI影响显著，X1X3对重楼皂苷VI影响极显著。因此，有必要进一步探讨氮-磷互作对重楼皂苷VI的影响。氮-磷互作效应和氮-钾互作效应重楼皂苷VI的方程分别见（16）、（17）。

由图4和图5可以看出不同浓度的氮肥、磷肥和钾肥都影响着重楼皂苷VI的提高，氮肥和磷肥的互作效应、氮肥和钾肥的互作效应利于重楼皂苷VI的提高。氮肥和磷肥的互作效应在1水平到1.681 8水平施肥有利于重楼皂苷VI的提高，是理想的互作区间；氮肥和钾肥的互作效应在1水平到1.681 8水平施肥有利于重楼皂苷VI的提高。

图4 X1X2互作效应含量变化Fig.4 X1X2 interaction effect on content changes

图5 X1X3互作效应含量变化Fig.5 X1X3 interaction effect on content changes

2.3.5 施肥方案的优选通过建立的产量回归模型就能算出各重楼皂苷最高含量下氮、磷、钾各最佳施用配方的理论值，因为考虑到实际生产过程温度、湿度和光照等环境因素的影响，通过因子频率计算得到一个合适的范围，见表7。

各重楼皂苷最佳施肥范围不同，但基本集中于0水平左右，取各重楼皂苷成分最佳施肥量范围交集的结果，确定最优施肥范围为氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2、钾肥461.61～502.65 kg/hm2。

3 讨论

施肥是达到药用植物高产优质的重要措施，合理的肥料配施不但能促进植物生长发育，提高药材产量，还可以改善药材品质，对中药材品质保障及土壤环境保护有重要意义[15-16]。

科学合理的氮、磷、钾肥配施对重楼药材浸出物、总皂苷等含量积累均具有一定影响[11,17-18]。在本课题组实际研究中发现七叶一枝花中含有重楼皂苷VII、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、重楼皂苷V，与前人[19-22]研究相符；本实验结果表明，氮、磷、钾肥料配施对七叶一枝花的重楼皂苷VII、重楼皂苷VI含量有显著影响；不同施肥处理下，除6、8、10、12和13号小区未能达到药典规定重楼皂苷I、重楼皂苷II和重楼皂苷VII总量不得少于0.6%的要求，其余小区样品均能满足药典规定。在试验因素范围内氮、磷和钾有利于七叶一枝花重楼皂苷VII含量的提高。重楼皂苷VII、重楼皂苷VI产量与氮、磷、钾肥的配施的相关性均达显著水平，当施用氮肥555.15～713.10 kg/hm2、磷肥2 542.20～3 376.20 kg/hm2、钾肥523.05～660.90 kg/hm2时，重楼皂苷VII含量大于0.20 %；当施用氮肥516.45～673.50 kg/hm2、磷肥2771.85～3649.20 kg/hm2、钾肥461.55～624.45 kg/hm2时，重楼皂苷VI含量大于0.09%。结合重楼皂苷V、Ⅳ、Ⅲ、II和I最高含量与氮、磷、钾肥配施相关性的理论值，取交集得最佳氮、磷、钾施肥范围为氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2和钾肥461.61～502.65 kg/hm2。