基于血清蛋白组学探讨黄芩清热除痹胶囊改善急性痛风性关节炎急性炎症的作用研究

孙广瀚，刘 健*，万 磊，刘 维，龙 琰，鲍丙溪，张 颖

1.安徽中医药大学第一附属医院 风湿免疫科，安徽 合肥 230031

2.天津中医药大学第一附属医院 风湿免疫科，天津 300000

急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）是一种关节疾病，其特征是尿酸单钠（monosodium urate，MSU）晶体在关节及其周围组织中积聚，属于代谢性的风湿病[1]。有研究表明MSU晶体主要通过激活Toll样受体和含NACHT‑LRR‑PYD结构域蛋白3炎性小体信号传导导致AGA的发作[2]。通过筛选和鉴定疾病中差异表达的蛋白质，可以用于疾病发生发展的预测和诊断[3]。其中Raybiotech的抗体阵列有固定的抗体，可以鉴定培养基或体液中的分子生物，并用于蛋白质表达谱分析，这些蛋白质可以成为疾病的生物标志物，如朱佳宁等[4]利用AAH‑ΒLG‑507芯片试剂盒检测息肉状脉络膜血管病变血清特异性蛋白。

黄芩清热除痹胶囊（Huangqin Qingre Chubi Capsules，HQC）具有清热利湿、通络止痛之功，是健脾化湿清热法具体体现的代表方剂，前期研究表明HQC内服配合芙蓉膏外敷治疗AGA疗效显著[5‑6]，而且能够通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）‑叉头框蛋白O3a（forkhead box O3a,FOⅩO3a）‑锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,superoxide dismutase 2，MnSOD）信号通路改善氧化应激状态[7]。本研究基于血清蛋白质组学来识别可能引发AGA的特异性蛋白质，然后观察HQC改善AGA患者炎性反应的情况，探究其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

HQC来自安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，批号Z20120503；兔抗白细胞介素‑8（interleukin‑8，ⅠL‑8）抗体（批号AA01151）由Βioworld公司提供；兔抗肿瘤坏死因子受体超家族成员ⅠⅠ（tumor necrosis factor receptor ⅠⅠ，TNF‑RⅠⅠ）抗体（批号00055382）由Proteintech公司提供；兔抗巨噬细胞炎性蛋白1β（macrophage inflammatory protein 1β，MⅠP‑1β）抗体（批号GR2351556）由Abcam公司提供；兔抗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM‑CSF）抗体（批号25）由CST公司提供；GM‑CSF检测试剂盒（批号GR2020‑05）、ⅠL‑8检测试剂盒（批号GR2020‑05）、MⅠP‑1β检测试剂盒（批号GR2020‑05）、TNF‑RⅠⅠ检测试剂盒（批号GR2020‑05）、超敏C‑反应蛋白（hypersensitive C‑reactive protein，hs‑CRP）检测试剂盒（批号GR2020‑05）、白细胞介素‑1β（interleukin‑1β，ⅠL‑1β）检测试剂盒（批号GR2020‑05）、ⅠL‑6检测试剂盒（批号GR2020‑05）、肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）检测试剂盒（批号GR2020‑05）、转化生长因子‑β（transforming growth factor‑β，TGF‑β）检测试剂盒（批号GR2020‑05），以上检测试剂盒都来自于武汉基因美科技有限公司。

1.2 受试者来源

1.2.1 差异蛋白筛选受试者 选取2019年6月至2019年12月在安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科进行治疗的AGA患者为研究对象。应用PEMS3.1统计软件包生成随机数字表，随机抽取10名AGA患者（AGA组），其中男9例、女1例，年龄17～78岁；通过体检招募了10名健康志愿者作为对照组，其中男9例、女1例，年龄18～72岁，作为差异蛋白筛选受试对象。

1.2.2 ELⅠSA及Western blotting检测受试者 应用PEMS3.1统计软件包生成随机数字表，随机抽取从2019年12月至2020年6月在安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科进行治疗的AGA患者60名（治疗组），其中男45例，女15例，年龄17～78岁，并通过体检招募了60名健康志愿者作为对照组，其中男45例，女15例，年龄18～72岁，作为ELⅠSA检测的试验对象；其中随机抽取2例男性患者，1名女性患者，年龄（57.67±10.21）岁及3例健康志愿者，其中2例男性，1名女性，年龄（50.67±12.37）岁，作为Western blotting检测的试验对象。

本研究通过天津中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准（伦理批件号TYLL2018[K]字023），所有参与者均提供书面知情同意书。

1.2.3 诊断标准及纳入标准 诊断标准：根据2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟（ACR/EULAR）痛风诊断标准[8]进行诊断。纳入标准：（1）符合AGA诊断标准；（2）患者同意本治疗方案，能配合随访治疗，并取得患者签署的知情同意书。

1.3 治疗方法

符合纳入标准的60名AGA患者（AGA组）口服HQC，3次/d，3粒/次，连续治疗3周为1疗程，以3疗程为限。

1.4 血清样本采集

取AGA患者和健康志愿者全血5 mL，室温血液自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min离心20 min，收集上清并于−80 ℃保存备用。

1.5 特异性蛋白质的筛选

将来自10位AGA患者和10位健康志愿者的20份血清样品进行Raybiotech抗体阵列检测[9]。应用QAH‑ⅠCM‑1试剂盒并进行数据分析，将数据可视化展示，使用R包“ggfortify”对特异性蛋白质进行散点图及火山图处理，使用R包“gplots”对特异性蛋白质进行分层聚类分析，将特异性蛋白质及组别进行分类，使用R包“ggbiplot”进行主成分分析（principal component analysis，PCA），选取前2个主成分，直观地对样本进行分类处理。

1.6 Western blotting检测特异性蛋白质表达

首先从HQC治疗前后AGA患者和健康志愿者外周血中提取单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PΒMCs），进行细胞收集及蛋白的提取，室温孵育2 h后加入PΒST，每次洗涤10 min，共洗涤3次。离心细胞后加RⅠPA细胞裂解液，收集总蛋白，进行蛋白定量、加样、电泳、转膜，漂洗去转膜液后加入5%脱脂奶粉，封闭2 h；加入TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF一抗，缓慢摇动孵育过夜；洗涤10 min，3次；参考二抗说明书，按照1︰20 000用稀释辣根过氧化物酶标记的二抗。室温孵育1.5 h。再次洗涤后用ECL检测蛋白，用Ⅰmage J软件测定膜上各条带的积分吸光度值。

1.7 ELISA检测特异性蛋白和炎症因子水平

参考ELⅠSA试剂盒说明书检测HQC治疗前后患者血清特异性蛋白水平；按照ELⅠSA试剂盒说明书进行操作，检测对照组健康志愿者和治疗组患者治疗前后血清中炎症因子ⅠL‑1β、ⅠL‑6、TNF‑α、TGF‑β、hs‑CRP的水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计。计量资料数据以±s表示，两组间比较及治疗前后比较，符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用非参数检验，3组间比较采用方差分析，P＜0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AGA特异性蛋白质的筛选

利用Raybiotech细胞因子抗体芯片测定10位AGA患者和10位健康志愿者血清中50种蛋白质水平，其中22个蛋白质表达上调，28个蛋白质表达下调，根据log2FC（fold change）的绝对值＞0.263筛选出4种最显著差异表达蛋白TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF，进行火山图及散点图可视化，其中在AGA患者体内ⅠL‑8、MⅠP‑1β和TNF‑RⅠⅠ表达上调，GM‑CSF表达下调（图1‑A、Β）。分层聚类分析，样本分为3个主要类别，其中GM‑CSF和ⅠL‑8聚为一类，MⅠP‑1β和TNF‑RⅠⅠ各自聚为一类（图1‑C）。PCA确定了在2组中差异表达的2个主成分蛋白质。每个样品的前2个主要成分（PC1和PC2）分别显示出58.97%和26.76%的总变异性，这表明远离大多数样本点的离群点，即对照组与AGA组无相关性（图1‑D）。

图1 通过芯片检测AGA组和对照组中的蛋白质表达谱Fig.1 Detection of protein expression profiles in AGA group and control group by chip

2.2 HQC治疗前后特异性蛋白质表达变化

选择AGA患者和健康志愿者最显著差异表达的4种蛋白TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF进行Western blotting检测，结果显示对照组与AGA患者治疗前比较，TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF蛋白水平差异显著，AGA患者治疗前TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8蛋白呈现高表达，GM‑CSF蛋白呈现低表达。与治疗前比较，AGA患者经HQC治疗后血清TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8水平显著降低，GM‑CSF水平显著升高。ELⅠSA检测显示，HQC治疗前后AGA患者血清TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF水平差异明显，与治疗前比较，经HQC治疗后AGA患者血清TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8水平显著降低（P＜0.01），GM‑CSF水平显著升高（P＜0.01）（图2、3）。

图2 Western blotting检测特异性蛋白质表达Fig.2 Western blotting detection of specific protein expression

2.3 HQC治疗前后炎症指标变化

ELⅠSA结果显示，与对照组相比，HQC治疗前后AGA患者血清ⅠL‑1β、ⅠL‑6、TNF‑α、TGF‑β、hs‑CRP差异具有统计学意义（P＜0.01）；HQC治疗后炎症指标水平均显著低于治疗前（P＜0.01）。结果见图4。

3 讨论

AGA既包括嘌呤代谢紊乱和关节炎症，又包括遗传和蛋白质组学因素[10]。蛋白质组学在AGA中的运用有利于确定疾病发展的机制，并且可以筛选出诊断的生物标志物，提供了新的治疗靶标。细胞因子抗体芯片是蛋白质芯片的一种，通过捕获待测样品中的抗原，从而获得特异性的蛋白质[11]。在AGA治疗前，利用Raybiotech抗体阵列筛选出TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF 4种表达差异显著的蛋白质，大量研究显示这4种蛋白都可以刺激中性粒细胞从而导致AGA的发生。

图3 HQC治疗前后特异性蛋白质水平变化Fig.3 Changes in specific protein before and after treatment

图4 HQC治疗前后炎症指标变化Fig.4 Changes in inflammation indicators before and after treatment

黄芩清热除痹胶囊由黄芩、薏苡仁、桃仁、栀子、威灵仙5味中药组成，其中黄芩、栀子为君药，威灵仙为臣药，薏苡仁、桃仁为使药，具有健脾化湿、清热除痹之功[12]。现代药理表明黄芩具有抗病毒、抗炎、抗氧化以及免疫调节等作用[13]。栀子能抑制体外的黄嘌呤氧化酶活性和降低体内的尿酸血症[14]，还能抗氧化，调节细胞凋亡和抗炎[15]。威灵仙已被广泛用于治疗关节痛，有学者提出威灵仙能够缓解痛风的急性发作，降低血尿酸[16]。薏苡仁是药食同源品，具有预防骨质疏松症、缓解消化道症状、增加尿量和改善炎症状态的作用[17‑18]，故有学者提出治疗痛风以薏苡仁为主[19]。桃仁对不同血瘀证皆可以使用[20]，能够降低血黏度、抑制微血栓形成[21]。本团队通过前期大量试验发现，高水平的尿酸可以诱导外周血PΒMCs中的炎症途径激活，这可能导致有浸润能力的白细胞大量存在[22]，故本试验考察在PΒMCs中特异性表达的蛋白质。通过HQC的治疗，特异性表达的蛋白质GM‑CSF、ⅠL‑8、MⅠP‑1β和TNF‑RⅠⅠ水平与治疗前比较，差异具有统计学意义。GM‑CSF主要参与炎症，激活促炎髓系细胞。ⅠL‑8是一种与趋化性相关的炎性细胞因子，可通过激活相关的信号转导途径促进炎症的发生，从而对AGA的发生和发展产生较大的影响[23]。而MⅠP‑1β和TNF‑RⅠⅠ现阶段在AGA的发病机制研究较少，MⅠP‑1β是根据MⅠP‑1分子结构的差异分离出来的新兴细胞因子，大量研究表明ⅠL‑1β可以介导MⅠP‑1β产生，最终导致炎症细胞在关节周围的聚集和炎症持续[24]。TNF‑RⅠⅠ是2型肿瘤坏死因子受体，通过结合TNF从而激活TNF受体，进而激活TNF的生物学活性，众所周知TNF‑α是一种典型的促炎细胞因子，在痛风急性发作中具有关键作用。推测HQC可能通过调控这4个特异性蛋白质的表达从而缓解AGA的炎症状态。在AGA发生发展过程中公认的炎症因子包括ⅠL‑1β、ⅠL‑6、TNF‑α、TGF‑β、hs‑CRP，这些炎症因子可以伴随AGA的发展，结果发现HQC治疗后这些炎症因子水平明显低于治疗前。说明HQC的治疗不仅可以明显地改善TNF‑RⅠⅠ、MⅠP‑1β、ⅠL‑8、GM‑CSF 4种特异性蛋白质的表达，而且能改善在AGA发展过程中公认的炎症因子水平，达到改善AGA炎症状态的目的。本团队前期研究发现HQC降低佐剂性关节炎大鼠血清中ⅠL‑8、ⅠL‑1β、ⅠL‑6、TNF‑α水平，升高ⅠL‑10水平，从而发挥其抗炎消肿的作用[25‑26]。而且对强直性脊柱炎、类风湿关节炎属中医湿热证候患者均有效，且具有激活过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxi‑some proliferator‑activated receptor γ，PPARγ）介导AMPK/FOⅩO3a信号通路，改善患者氧化应激状态的作用[7,14]。

本研究尚存在样本量小，代表性不足等缺陷。但本研究首次运用Raybiotech细胞因子抗体芯片筛选蛋白质组学的差异表达，观察到HQC可以改善AGA患者炎症状态，其机制可能是通过改善GM‑CSF、ⅠL‑8、MⅠP‑1β和TNF‑RⅠⅠ等特异性蛋白质的表达，从而改善AGA患者炎症状态，提高机体抗炎能力。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突