芪珍胶囊抗结肠癌的作用机制研究

郭丹丹，郭铖洁，桑婷婷，王玉洁，吴凯凯，郭翠玲，方 柳，王兴亚

浙江中医药大学，浙江 杭州 310053

结肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率和死亡率高，转移性结肠癌患者的5年生存率不超过10%[1-4]。目前，手术、化疗、放疗及靶向手段是治疗结肠癌的主要策略。然而，这些传统的治疗方式具有术后并发症、耐药性及不良反应等局限性。近年来，中医药因其疗效显著、不良反应少而被广泛用于防治癌症。天然化合物或补充剂具有潜在的抗癌作用[5-6]。紫杉醇可以逆转非小细胞肺癌干细胞对顺铂诱导的耐药性[7]，对乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、结肠癌和肺癌均有明显的治疗作用[8-9]。参麦注射液主要由红参和麦冬组成，可通过改善化疗药物阿霉素和紫杉醇在小鼠体内的亚细胞分布，增强对结肠癌细胞的毒性[10]。康莱特®注射液（薏苡仁提取物）与吉西他滨联用可显著提高局部晚期或转移性胰腺癌患者的无进展生存期[11]。金龙胶囊可抑制胃癌细胞增殖，并促进其凋亡[12]。

芪珍胶囊是一种有效的抗癌中药制剂，临床用于肺癌、乳腺癌和胃癌的辅助治疗，主要由珍珠、黄芪、三七、大青叶和重楼组成，具有益气化瘀、清热解毒的功效。芪珍胶囊主要活性成分为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。芪珍胶囊与多西他赛或顺铂等化疗药物联用，能够协同抑制乳腺癌、晚期非小细胞肺癌、胃癌患者的肿瘤生长，提高患者免疫功能和生活质量[13-16]。芪珍胶囊可以增加乳腺癌患者CD4/CD8细胞，改善免疫功能，缓解放化疗引起的骨髓抑制等不良反应[17]。目前，芪珍胶囊对结肠癌的作用及其抗肿瘤的作用机制尚不清楚。人结肠癌细胞HCT116是从结肠癌的男性患者中分离的恶性细胞株，由于其在无胸腺的裸鼠中具有较好致瘤性，可形成上皮样肿瘤，被广泛用于结肠癌研究[18]。本研究从体内外探究芪珍胶囊抗结肠癌的作用及机制，为其临床应用提供依据。

1 材料

1.1 细胞

HCT116细胞购自美国ATCC。

1.2 动物

SPF级BALB/c雄性裸鼠60只，4周龄，体质量18～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SYXK2018-0012。动物饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，温度（24±2）℃、湿度（50±10）%，保持良好通风，自由进食饮水。动物实验经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会批准（批准号ZSLL-2018-015）。

1.3 药品与试剂

芪珍胶囊（批号160908，0.3 g/粒）购自宁波大昌药业有限公司，经高效液相色谱法测定每粒芪珍胶囊含4.85 mg三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，符合《中国药典》2015年版规定；氟尿嘧啶注射液（批号02170302，0.25 g/支）购自山西普德药业有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素混合液、0.25%胰酶购自美国Gibco公司；MTT购自美国AMRESCO公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；β-actin抗体（批号4967S）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗体（批号9542S）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号2876S）、程序性死亡分子配体-1（programmed death ligand 1，PD-L1）抗体（批号13684T）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（批号9665）、Caspase-9抗体（批号9508）、剪切型Caspase-9（cleaved Caspase-9）抗体（批号7237P）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗体（批号2983S）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗体（批号5536S）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抗体（批号2603S）、p-AMPK抗体（批号2535S）、细胞外信号调节蛋白激酶（extraeellular signal regulated kinase，ERK）抗体（批号9102S）、p-ERK抗体（批号4377）、p38抗体（批号9218S）、p-p38抗体（批号9211S）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体购自美国CST公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号23209）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；ECL显影液（批号170-5061）、EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒（批号RN07）购自北京艾德莱生物科技有限公司；iTaqTM Universal SYBR Green Supermix（批号172-5124）购自美国BIO-RAD公司；PCR试剂盒（批号R2233-01）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；人重组γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ，批号071527-3）购自美国PEPROTECH公司；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号MM-0049H2）、IL-1β ELⅠSA试剂盒（批号MM-0181H2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号MM-0122H2）购自江苏酶免实业有限公司；β-actin、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、TNF-α、IL-6、CD68、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、PD-L1引物购自上海生工生物技术有限责任公司。

1.4 仪器

CKX31SF倒置显微镜（日本Olympus公司）；HYC-360型4 ℃医用冷藏箱、DW-25L262型−20 ℃医用低温冷藏箱（青海海尔特种电器有限公司）；902型 −80 ℃超低温冰箱、3111型CO2培养箱、1300SERIES A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ELX808型酶标仪（美国BIOTEK公司）；GeneAmp 9700型基因扩增仪（美国Applied Biosystems公司）；CFX96型实时荧光定量PCR仪、蛋白电泳仪（美国BIO-RAD公司）；MiniChemiTM610型化学成像分析仪（北京赛智创业科技有限公司）；5424R型高速离心机、5404型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

HCT116细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

2.2 芪珍胶囊对HCT116细胞存活率的影响

取处于对数生长期的HCT116细胞，以1×104/mL接种于96孔板中，培养至细胞融合度为50%。芪珍胶囊溶于含10%胎牛血清的DMEM培养基，配制成质量浓度为2.1 mg/mL的母液，经0.22 μm滤膜滤过，使用时以DMEM培养基稀释。设置对照组和芪珍胶囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）组，各给药组加入200 μL相应药物，对照组加入不含药物的培养基，分别培养24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h；每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），室温振荡10 min，采用多功能酶标仪于490 nm测定吸光度（A）值，以空白对照孔的A值作为参照，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)

2.3 芪珍胶囊对HCT116细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的HCT116细胞，以2×105/孔接种于6孔板中，培养至细胞融合度为50%。设置对照组和芪珍胶囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h，收集细胞，以含Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）的结合缓冲液重悬，避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，以早期凋亡细胞（Annexin V＋/PI－）和晚期凋亡细胞（Annexin V＋/PI＋）计算凋亡率。

2.4 芪珍胶囊对HCT116细胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表达的影响

按“2.3”项下方法处理细胞，收集细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉于室温封闭1 h，分别加入Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗涤4次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG抗体（1∶2000），室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤4次，加入ECL显影液，采用化学成像分析仪曝光并拍照。

2.5 芪珍胶囊对HCT116细胞PD-L1 mRNA表达的影响

按“2.3”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书提取各组细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：β-actin上游引物5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’、下游引物5’-AAGGAACTTCCTTGAACAATGCA-3’；PD-L1上游引物5’-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3’、下游引物5’-AGCCCTCAGCCTGACATGTC-3’。

2.6 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型的影响

BALB/c裸鼠随机分为对照组及芪珍胶囊低、高剂量（1.5、4.5 g/kg，分别相当于临床2、6倍剂量）组、氟尿嘧啶（20 mg/kg）组、芪珍胶囊（1.5 g/kg）联合氟尿嘧啶（20 mg/kg）组，每组12只。取处于对数生长期的HCT116细胞，将细胞密度调整为2.5×107/mL，于裸鼠背部sc 0.2 mL细胞悬液，7～10 d后，裸鼠皮下出现结节，表明移植瘤模型建立成功。芪珍胶囊溶于生理盐水，分别配制成质量浓度为150、450 mg/mL的溶液；氟尿嘧啶以生理盐水配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液。自造模第2天开始，芪珍胶囊组ig相应药物，对照组ig 0.2 mL生理盐水，1次/d；氟尿嘧啶组ip药物，每2天1次，连续5周。每周称定各组裸鼠体质量，测量肿瘤长径（a）及与长径垂直的瘤体最宽径（b），计算肿瘤体积。

肿瘤体积＝ab2/2

2.7 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

末次给药24 h后，裸鼠用CO2窒息处死，心脏取血，血液室温静置至析出，4 ℃、3000 r/min离心15 min，吸取上清，按试剂盒说明书检测各组裸鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.8 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表达的影响

裸鼠处死后，取肿瘤组织，称定质量，按照试剂盒说明书提取各组裸鼠肿瘤组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：NF-κB上游引物5’-ATGGCTTCTATGAGGCTGAG-3’、下游引物5’-GTTGTTGTTGGTCTGGATGC-3’；TNF-α上游引物5’-AGAGGGAGAGAAGCAACTACA-3’、下游引物5’-GGGTCAGTATGTGAGAGGAAGA-3’；IL-6上游引物5’-CGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTG-3’、下游引物5’-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTCT-3’；CD68上游引物5’-TTGGGTGAGGCGGTTCAGCCA-3’、下游引物5’-GTGCTCTCTGTAACCGTGGGTGT-3’；MCP-1上游引物5’-TGGCTGTGTTTGCTTCTGTC-3’、下游引物5’-TCTCACTGCCCTATGCCTCT-3’；iNOS上游引物5’-GGAAGCGGTAACAAAGGA-3’、下游引物5’-GCCAGCATAGCGGATG-3’；其余引物序列见“2.5”项。

2.9 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织PD-L1蛋白表达的影响

取各组裸鼠肿瘤组织，加入500 μL RIPA裂解液，使用匀浆机充分破碎肿瘤组织，4 ℃、13 000 r/min离心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。按“2.4”项下方法检测各组裸鼠肿瘤组织PD-L1蛋白表达情况。

2.10 芪珍胶囊对IFN-γ诱导的HCT116细胞存活率的影响

取处于对数生长期的HCT116细胞，以1×104/mL接种于96孔板中，培养至细胞融合度为50%。设置对照组、模型组、芪珍胶囊（0.4、0.7 mg/mL）组、芪珍胶囊（0.4、0.7 mg/mL）联合IFN-γ（10 ng/mL）组，模型组和联合给药组加入IFN-γ（10 ng/mL），各给药组加入200 μL芪珍胶囊溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h。按“2.2”项下方法测定各组细胞存活率。

2.11 芪珍胶囊对IFN-γ诱导的HCT116细胞PD-L1蛋白表达的影响

取处于对数生长期的HCT116细胞，以2×105/孔接种于6孔板中，培养至细胞融合度为50%。设置对照组、模型组和芪珍胶囊（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）组，模型组和各给药组加入IFN-γ（10 ng/mL），各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h。按“2.4”项下方法检测各组细胞PD-L1蛋白表达情况。

2.12 统计学方法

计量资料以±s表示，采用SPSS 19.0软件及GraphPad Prism 5软件进行数据分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或t检验对各组数据进行比较。

3 结果

3.1 芪珍胶囊对HCT116细胞存活率的影响

如图1所示，与对照组比较，芪珍胶囊组细胞存活率显著降低（P＜0.01、0.001），呈剂量和时间相关性。

图1 芪珍胶囊对HCT116细胞存活率的影响(±s ,n=3)Fig.1 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.2 芪珍胶囊对HCT116细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组比较，芪珍胶囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）组细胞晚期凋亡率显著升高（P＜0.01、0.001），芪珍胶囊（0.7 mg/mL）组细胞早期凋亡率显著升高（P＜0.01）。

图2 芪珍胶囊对HCT116细胞凋亡的影响 (±s ,n=3)Fig.2 Effect of Qizhen Capsule on apoptosis in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.3 芪珍胶囊对HCT116细胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表达的影响

如图3、4所示，与对照组比较，芪珍胶囊（0.6、0.7 mg/mL）组细胞Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），芪珍胶囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）组细胞cleaved Caspase-9、cleaved PARP和p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01、0.001），各剂量芪珍胶囊组细胞p-mTOR/mTOR、p-ERK/ERK和p-p38/p38蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

图3 芪珍胶囊对HCT116细胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和PARP蛋白表达的影响 (±s ,n=3)Fig.3 Effect of Qizhen Capsule onexpressions of Caspase-9,cleaved Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2,and PARP in HCT116 cells(±s ,n=3)

3.4 芪珍胶囊对HCT116细胞PD-L1 mRNA表达的影响

如图5所示，与模型组比较，芪珍胶囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）组细胞中PD-L1mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。

3.5 芪珍胶囊对结肠癌裸鼠移植瘤的影响

图4 芪珍胶囊对HCT116细胞mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表达的影响(±s ,n=3)Fig.4 Effect of QizhenCapsule on expressions of mTOR,p-mTOR,AMPK,p-AMPK,ERK,p-ERK,p38,and p-p38 in HCT116 cells (±s ,n=3)

图5 芪珍胶囊对HCT116细胞PD-L1 mRNA表达的影响(±s ,n=3)Fig.5 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 mRNA level in HCT116 cells (±s ,n=3)

如图6-A所示，对照组和氟尿嘧啶组裸鼠体质量均低于芪珍胶囊组，联合用药组裸鼠体质量高于模型组和氟尿嘧啶组，提示芪珍胶囊可减轻氟尿嘧啶的不良反应。如图6-B、C所示，与对照组比较，芪珍胶囊高剂量组、氟尿嘧啶组和联合用药组裸鼠肿瘤体积显著减小（P＜0.05、0.01）。如图6-D所示，与对照组比较，芪珍胶囊高剂量组、氟尿嘧啶组和联合用药组裸鼠瘤质量显著降低（P＜0.05、0.01），表明芪珍胶囊能有效抑制裸鼠肿瘤生长，减轻氟尿嘧啶诱导的体质量减轻。

图6 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型体质量 (A)、肿瘤体积 (B)、肿瘤终体积 (C) 和肿瘤质量 (D) 的影响 (±s ,n=12)Fig.6 Effect of Qizhen Capsule on bodyweight (A),tumor volume (B),average final tumor volume (C),and tumor weight (D)of nude mouse xenografts (±s ,n=12)

3.6 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

如图7所示，与对照组比较，各给药组裸鼠血清中TNF-α和IL-6水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），芪珍胶囊高剂量组、氟尿嘧啶组和联合用药组裸鼠血清中IL-1β水平显著降低（P＜0.05、0.01）。

图7 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响 (±s ,n=3)Fig.7 Effect of Qizhen Capsule on levels of TNF-α,IL-6,and IL-1β in serum of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.7 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表达的影响

如图8所示，与对照组比较，各给药组裸鼠肿瘤组织中CD68mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），芪珍胶囊高剂量组、氟尿嘧啶组和联合用药组裸鼠肿瘤组织中NF-κB、TNF-α、IL-6和MCP-1mRNA表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），芪珍胶囊低剂量组、氟尿嘧啶组和联合用药组裸鼠肿瘤组织中iNOSmRNA表达水平显著降低（P＜0.05），芪珍胶囊高剂量组和联合用药组裸鼠肿瘤组织中PD-L1mRNA表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。

图8 芪珍胶囊对对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表达的影响(±s ,n=3)Fig.8 Effect of Qizhen Capsule on mRNA levels of NF-κB,TNF-α,IL-6,CD68,MCP-1,iNOS,and PD-L1 in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.8 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织PD-L1蛋白表达的影响

如图9所示，与对照组比较，芪珍胶囊高剂量组和联合用药组裸鼠肿瘤组织中PD-L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。

图9 芪珍胶囊对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织PD-L1蛋白表达水平的影响 (±s ,n=3)Fig.9 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.9 芪珍胶囊对IFN-γ诱导的HCT116细胞存活率的影响

如图10所示，与对照组比较，模型组细胞存活率无明显变化；与模型组比较，各给药组细胞存活率显著降低（P＜0.001）。

图10 芪珍胶囊对IFN-γ诱导的HCT116细胞存活率的影响 ()Fig.10 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

3.10 芪珍胶囊对IFN-γ诱导的HCT116细胞PD-L1蛋白表达的影响

IFN-γ是促进PD-L1表达最强的刺激因子[19]。如图11所示，与对照组比较，模型组细胞PD-L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，芪珍胶囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）组细胞PD-L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）。以上结果表明芪珍胶囊可以抑制PD-L1在异种移植瘤中的表达，也可以抑制IFN-γ诱导的HCT116细胞中PD-L1表达，提示芪珍胶囊可能在结肠癌中起到免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICPI）的作用。

图11 芪珍胶囊对IFN-γ诱导HCT116细胞中PD-L1蛋白表达的影响 ()Fig.11 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

4 讨论

免疫治疗，尤其是ICPI治疗，对结肠癌有良好的疗效[20-21]。抗PD-1药物如pembrolizumab、nivolumab已被FDA批准并用于治疗不匹配修复缺陷和微卫星不稳定性高型结肠癌患者[21]。由于患者复杂的分子遗传特征，不同的结肠癌亚群对免疫治疗有不同的反应[22]。然而，ICPI对呼吸系统、皮肤和胃肠道等器官均具有毒性作用[23]。因此，开发有效且安全的ICPI药物对转移性结肠癌的治疗至关重要。中药具有良好的抗癌作用，可降低ICPI诱导的免疫相关不良反应，是一种有前景的免疫治疗药物的辅助/替代品[23-24]。本研究发现，芪珍胶囊通过抑制HCT116细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节信号转导级联并抑制IFN-γ诱导的PD-L1蛋白表达，从而抑制结肠癌细胞生长。芪珍胶囊能够抑制裸鼠移植瘤模型肿瘤生长，抑制炎性反应，缓解氟尿嘧啶引起的体质量下降，抑制免疫缺陷小鼠PD-L1表达，提示芪珍胶囊是一种有潜力的抗结肠癌ICPI药物。

肿瘤的发生是一个复杂的过程，免疫系统作为机体的防御系统，可以通过适应性或获得性免疫反应有效地识别外来物质并将其清除[25]。研究表明，免疫检查点分子包括PD-1和PD-L1，均为结肠癌免疫治疗的可能靶点[26]。PD-L1在结肠癌组织中高表达[26]。靶向阻断肿瘤PD-1/PD-L1结合可增强抗肿瘤药物的免疫应答，为肿瘤免疫治疗提供机会。肿瘤PD-L1可调节肿瘤细胞的免疫非依赖性和内在功能，直接调节细胞凋亡和自噬[27]。本研究发现，芪珍胶囊显著降低裸鼠移植瘤模型肿瘤组织PD-L1表达，降低肿瘤体积和肿瘤质量。在免疫缺陷小鼠和免疫功能小鼠中，卵巢癌、黑色素瘤和结肠癌细胞中PD-L1表达下调，癌细胞增殖和肿瘤形成被抑制[27-28]，与本研究结果一致，表明一种新的肿瘤细胞固有的PD-L1效应可能是非免疫介导的，也表明PD-L1作为一种潜在的抗癌生物标志物具有更广泛的作用。本研究结果显示，IFN-γ诱导的HCT116细胞中PD-L1蛋白表达水平升高[29]，芪珍胶囊显著抑制IFN-γ诱导的HCT116细胞中PD-L1蛋白表达水平；而与模型组比较，氟尿嘧啶对裸鼠移植瘤模型肿瘤组织中PD-L1表达却无明显影响。有研究发现，氟尿嘧啶能够诱导HCT116细胞PD-L1表达上调，可能是氟尿嘧啶诱导癌细胞耐药或氟尿嘧啶诱导免疫耐药所致[30]。综上，芪珍胶囊可通过靶向PD-L1表达抑制结肠癌细胞增殖，可能是其发挥有效的免疫或非免疫介导的抗癌作用机制。

炎性反应可促进肿瘤的发生，在癌变过程中发挥重要作用[31]。20%～40%结肠癌患者存在系统性炎性反应[32]。结肠癌患者血清中IL-6和TNF-α水平升高，且IL-6和TNF-α的共同表达与患者预后差相关[33]。IL-1β和IL-6的表达均位于结肠癌上皮和基质中[34]。本研究结果显示，芪珍胶囊可以显著降低裸鼠移植瘤模型血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平。白藜芦醇和三七能够降低IL-6、TNF-α和IL-1β表达[35-36]。三七能够抑制脂多糖诱导的小鼠DC2.4细胞中IL-6和TNF-α的分泌[37]。本研究发现，与模型组比较，芪珍胶囊显著抑制裸鼠移植瘤模型肿瘤组织中NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1和iNOSmRNA表达水平，提示芪珍胶囊可能通过抑制炎性反应，抑制结肠癌发展。

持续存在的细胞增殖信号、规避生长抑制因子、促进侵袭和转移、细胞永生化、诱导血管生成、抵御细胞凋亡是癌症的特征，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[38]。本研究发现，芪珍胶囊显著抑制HCT116细胞增殖，呈剂量相关性，可能与诱导细胞凋亡有关。细胞凋亡是由多种基因调控的过程，PARP是细胞凋亡的标志，抗凋亡分子Bcl-2在结肠癌中高表达[39]。本研究结果显示，芪珍胶囊下调HCT116细胞中Bcl-2蛋白表达水平，上调cleaved Caspases-9和cleaved PARP蛋白表达水平。研究发现，黄芪皂苷能够上调HT-29细胞中cleaved PARP表达，下调Bcl-2和Caspase-3表达[40]。mTOR[41]、AMPK[42]和MAPK[43]等多种信号通路可以调节细胞增殖和凋亡。MAPK/ERK的激活能够诱导细胞凋亡[44-45]。本研究发现，芪珍胶囊能够激活HCT116细胞中mTOR、AMPK、ERK和p38信号通路，提示这些通路可能是芪珍胶囊在HCT116细胞中发挥抗癌作用的潜在下游信号级联通路。

综上所述，芪珍胶囊能够通过诱导细胞凋亡、抑制炎症及PD-L1表达等途径抑制结肠癌的发生发展，可能是一种潜在的ICPI。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突