人参皂苷Rg3联合苏拉明对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及相关基因表达的影响

陶 涛

（蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠 233004）

肺癌的发生可受到多种因素的影响，其发病机制尚未完全阐明。研究发现，环境污染、长时间接触致癌物等都是引发肺癌的重要原因[1]。近年来，人参皂苷Rg3 和苏拉明被广泛地应用于肺癌的治疗中。本次研究主要是分析联用人参皂苷Rg3 和苏拉明对Lewis 肺癌小鼠进行治疗对其移植瘤的抑制作用及相关基因表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象是40 只小鼠，包括4 只Lewis 肺癌荷瘤小鼠和36 只C57BL/6 雌性小鼠。这些小鼠的平均鼠龄为（4.1±0.5）周，平均的体质量为（17.05±2.05）g。这些小鼠均购自于医学科学院实验动物研究所。

1.2 研究方法

本次实验使用的药物是人参皂苷Rg3 和苏拉明。人参皂苷Rg3 购自于成都曼斯特生物公司，苏拉明购自于美国Sigma 公司。对研究对象中的4 只荷瘤小鼠进行肿瘤接种。在接种后的2 周，提取移植瘤组织，严格遵循无菌操作的原则处死小鼠。剥离移植瘤，取1 g 的肿瘤组织作为标本，放到4 mL 的生理盐水匀浆器中进行研磨，经组织匀浆液过360 目钢网得到单细胞悬液。取出肿瘤组织标本，在显微镜下观察肿瘤细胞的数量。在肿瘤组织标本中加入适量的生理盐水，以确保肿瘤细胞的密度达到2×106个/mL。取0.2 mL的悬液注射到C57BL/6 小鼠右侧大腿的内侧，建立移植瘤小鼠模型。接种肿瘤的36 只C57BL/6 小鼠均成瘤。在肿瘤接种的第4 天，将36 只C57BL/6 小鼠分为对照组、人参皂苷Rg3 组、苏拉明组、联合组，每组各有9 只小鼠。在对照组小鼠的腹腔内注射0.2 mL 的生理盐水，在其胃内灌注0.2 mL 的生理盐水，1 次/d。在人参皂苷Rg3 组小鼠的胃内灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人参皂苷Rg3 的药液，在其腹腔内注射0.2 mL 的生理盐水，1 次/d。在苏拉明组小鼠的腹腔内注射0.2 mL、含10 mg/kg 苏拉明的药液，在其胃内灌注0.2 mL 的生理盐水，1 次/d。在联合组小鼠的腹腔内灌注0.2 mL、含10 mg/kg 苏拉明的药液，在其胃内灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人参皂苷Rg3 的药液，1 次/d。对四组小鼠均给药15 d。

1.3 观察指标及抑制肿瘤效果的评定标准

1）治疗后，采用原位末端凋亡法（TUNEL）进行细胞凋亡检测，严格参照检测说明书进行操作。将已知的阳性切片作为参照。阳性细胞（肿瘤细胞）的评定标准是：在细胞核内出现棕黄色颗粒。选择阳性细胞分布密集的区域。统计每个切片中10 个高倍视野中阳性细胞及正常细胞的总数。若肿瘤细胞凋亡，可判定抑制肿瘤有效。抑瘤率= 抑制肿瘤有效的小鼠数/ 小鼠的总数×100%。2）取出移植瘤后，对肿瘤进行称重，记录肿瘤的质量。3）对四组小鼠的肿瘤组织切片进行染色，选择4 个视野，在高倍视野范围内统计染色肿瘤微血管的数量，取其均值作为切片中肿瘤微血管密度（MVD）值。4）采用RT-PCR 法测定四组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量，采用蛋白质印迹法测定其肿瘤细胞中MEK1/2 蛋白的表达量。

1.4 统计学方法

对本次研究中的数据均采用SPSS21.0 统计软件进行处理，计量资料用±s表示，用t检验，计数资料用%表示，采用χ²检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠移植瘤的质量、抑瘤率、MVD 值的比较

人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠、联合组小鼠移植瘤的质量均小于对照组小鼠，P＜0.05。人参皂苷Rg3组小鼠、苏拉明组小鼠移植瘤的质量均大于联合组小鼠，P＜0.05。人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠、联合组小鼠的抑瘤率均高于对照组小鼠，P＜0.05。人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠的抑瘤率均低于联合组小鼠，P＜0.05。参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠、联合组小鼠的MVD 值均小于对照组小鼠，P＜0.05。人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠的MVD 值均大于联合组小鼠，P＜0.05。详见表1。其中，对照组小鼠和联合组小鼠MVD 值的表达情况见图A 和图B。

2.2 四组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2mRNA 的相对表达量及MEK1/2 蛋白表达量的比较

对照组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量高于人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠、联合组小鼠，P＜0.05。人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量均高于联合组小鼠，P＜0.05。对照组小鼠、人参皂苷Rg3 组小鼠、苏拉明组小鼠、联合组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 蛋白的表达量相比，P＞0.05。详见表2。

表1 四组小鼠移植瘤的质量、抑瘤率、MVD 值的比较（± s）

表1 四组小鼠移植瘤的质量、抑瘤率、MVD 值的比较（± s）

注：* 表示与对照组小鼠相比，P ＜0.05；&表示与联合组小鼠相比，P ＜0.05。

MVD 值（条/0.732 mm2）对照组 9 5.58±2.15& 0& 24.15±3.68&人参皂苷Rg3 组 9 3.61±1.08*& 35.26±5.08&* 13.24±2.18*&苏拉明组 9 3.59±1.04*& 35.26±5.57&* 12.35±2.04*&联合组 9 2.81±0.35* 49.68±5.47* 6.15±2.07*组别 例数 移植瘤的质量（g）抑瘤率（%）

注：图A 为对照组小鼠移植瘤的MVD 图，图B 为联合组小鼠移植瘤的MVD 图

表2 四组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量及MEK1/2 蛋白表达量的比较（%，± s）

表2 四组小鼠肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量及MEK1/2 蛋白表达量的比较（%，± s）

对照组（n=9） 人参皂苷Rg3 组（n=9） 苏拉明组小鼠（n=9） 联合组（n=9）MEK1/2 mRNA 的相对表达量 71.25±15.26 45.26±10.36 43.15±8.34 28.67±5.19 MEK1/2 蛋白的表达量 0.32±0.14 0.33±0.11 0.35±0.14 0.33±0.05

3 讨论

肺癌患者肿瘤内的血管较为丰富，生长速度较快，导致多数晚期肺癌患者失去了进行手术的最佳时机[2]。对于不同分型的肺癌患者，需要采用不同的靶向药物进行治疗。肿瘤细胞易出现耐药性，较易出现基因突变的情况。部分靶向药物仅对某个基因突变的肿瘤细胞有效，且单一用药的效果有限[3]。人参皂苷Rg3 是人参中的有效活性成分。对于心脑血管疾病、四肢乏力、腿脚不便、记忆力减退等中老年人常见疾病都有很好的治疗效果。近年来，临床上常用人参皂苷Rg3 对恶性肿瘤患者进行治疗，以抑制癌细胞的转移。在不同分型的人参皂苷中，人参皂苷Rg3 的调节免疫和抗肿瘤作用最为显著。苏拉明属于尿素衍生物，是近年来临床应用范围较广的一种抗肿瘤药。联用苏拉明和人参皂苷Rg3 治疗肺癌的效果有待临床上的进一步研究[4]。

研究发现，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成。MVD 与肿瘤的侵袭性有关，是预测癌细胞是否发生转移及患者预后的可靠指标[5]。本次研究的结果显示，与对照组小鼠相比，联合组小鼠的MVD 值更小。这说明，将人参皂苷Rg3和苏拉明联合应用，可发挥较为明显的抑制移植瘤作用。

本次研究的结果证实，联用人参皂苷Rg3 和苏拉明对Lewis 肺癌小鼠进行治疗，可明显抑制其移植瘤的生长，并可降低其肿瘤细胞中MEK1/2 mRNA 的相对表达量。