盐胁迫对野菊和神农香菊及其杂交F1代光合生理的影响1)

刘筱玮 夏斌 陈斌 杨扬 何淼

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

土壤盐渍化是人类面临的全球性难题，全世界约有10亿hm2的盐渍化土地，中国盐渍土总面积达3 600万余hm2，占全国可利用土地面积的4.88%，且盐渍土地面积仍在不断增加[1-2]。土壤是植物赖以生存的必要条件之一，土壤盐渍化会引起植物产生渗透胁迫、离子胁迫和营养失衡，影响植物的生存和生长，进而造成盐渍土地区植物种类少，覆盖度低和植物景观效果单一等突出问题[3]，而为盐渍土地区筛选和扩大适宜生存的园林植物种类也已成为解决此类问题的关键。

光合作用是植物生长发育的物质和能量基础[4]，植物光合作用对土壤盐碱化的反应极其敏感[5]，高盐胁迫能使植物光合器官遭到破坏，叶绿素降解，光合能力下降[6-7]；光合参数和叶绿素荧光参数的变化能反映植物受到的盐胁迫的损伤程度，用于评价植物对盐胁迫的适应能力[8-9]。

野菊(Chrysanthemumindicum)是菊科(Compositae)菊属多年生草本植物，分布范围广，茎秆直立粗壮，抗性较强，具有耐盐育种潜力[10]。神农香菊(Ch.indicumvar.aromaticum)是野菊的一个变种，全株具有浓郁香气，是重要的芳香菊花种质资源，但其茎秆柔弱，全株匍匐，有关其耐盐性未见报道[11-12]。菊花为我国传统名花，观赏及商用价值较高，其在盐渍土地区的应用和推广对盐渍土地区增加园林植物种类，丰富植物景观效果具有重要意义，利用分子育种、菊花近缘优良种质进行菊花品种改良等可实现菊花种质创新[13]。本课题组在前期的研究中利用野菊作为父本，神农香菊作为母本进行杂交，获得F1代杂交群体，并从中筛选得到5个茎秆粗壮、气味芳香的优良株系。本试验以野菊、神农香菊及其杂交F1代5个优良株系为试验材料，探究它们在不同NaCl浓度胁迫下光合生理的变化规律并对它们的耐盐性进行评价，以期筛选出具有芳香性状的耐盐新株系，为丰富盐渍土地区绿化植物种类提供新的植物资源。

1 材料与方法

1.1 试验处理

试验于2019年5—7月在黑龙江省哈尔滨市东北林业大学花卉研究所苗圃进行。供试材料为野菊、神农香菊及以野菊为父本、神农香菊为母本获得的杂交F1代群体中5个优良株系。为方便叙述，5个F1代株系编号依次为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5。

采集野菊、神农香菊及5个F1代株系健康的嫩梢扦插于穴盘之中，扦插基质为河沙。待插穗生根后移栽于上下直径分别为14、9 cm，高12 cm的塑料花盆中，栽培基质为V(腐殖土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=2∶1∶1，pH为6.65，每盆干栽培基质0.5 kg，每盆1棵植株。移栽后进行常规的养护管理，待植株8叶龄时，选取长势一致、生长健壮的植株进行试验。

试验分别设置0、100、200、400 mmol·L-14个NaCl浓度梯度，每个处理3个重复，每个重复18盆植物，每隔3 d浇1次溶液，每盆120 mL，为防止盐分流失，花盆下放置等大的托盘，将渗出的盐溶液再次倒回花盆中，反复几次，直至土壤充分吸收盐溶液。处理12 d后，测定各项相关指标。

1.2 测定指标

叶绿素质量分数测定：取不同处理植株从顶芽数第3—第5片发育成熟的叶片，采用丙酮-乙醇混合液浸提法[14]测定并计算叶绿素a质量分数、叶绿素b质量分数、叶绿素(a+b)质量分数。

光合参数的测定：选取不同处理植株从顶芽数第3片发育成熟的叶片，使用便携式光合仪Li-6400(美国LI-COR公司)于晴天09:00—11:00测定其净光合速率(Pn，μmol·m-2·s-1)、气孔导度(Gs，mol·m-2·s-1)、胞间CO2摩尔分数(Ci，μmol·mol-1)和蒸腾速率(Tr，mmol·m-2·s-1)，并计算水分利用效率(WUE=Pn/Tr)。叶室设定的光照强度为1 000 μmol·m-2·s-1，温度设置为25 ℃，CO2气源为室外大气CO2。每个处理随机测3株植株，每株植物记录6次数据。

叶绿素荧光参数的测定：与光合参数测定同步，将功能叶暗处理30 min后，采用便携式叶绿素荧光成像仪Fluorcam(捷克PSI公司)测定PSⅡ最大光能转换效率(Fv/Fm)、PSI潜在活性(Fv/F0)、PSⅡ光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)以及非光化学猝灭系数(NPQ)。

1.3 综合评价

采用Fuzzy数学中隶属函数法进行综合评价[15-16]。

与耐盐性正相关的指标采用公式(1)计算，与耐盐性负相关的指标采用公式(2)计算。

Y(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

(1)

Y(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

(2)

式中：Xi为指标测定值；Xmin、Xmax分别为样品某一指标的最小值和最大值。

1.4 数据处理

使用Excel 2012对数据进行整理和制图、利用SPSS 22.0对所得数据进行相关性分析、主成分分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对亲本及F1代叶片叶绿素质量分数的影响

叶绿素质量分数的高低在一定程度上能反映出植物光合潜能的大小。如表1所示，野菊叶片的叶绿素a质量分数在NaCl胁迫浓度为100 mmol·L-1时与对照相比显著下降(P<0.05)，其余株系均在盐浓度为200 mmol·L-1时与对照相比达到显著差异水平(P<0.05)。神农香菊、Z3、Z4、Z5叶片的叶绿素b质量分数在盐浓度为100 mmol·L-1时与对照相比显著下降(P<0.05)。野菊、神农香菊、Z4、Z5叶片的叶绿素(a+b)质量分数在盐浓度为100 mmol·L-1时与对照相比显著下降(P<0.05)，Z1、Z2、Z3叶片的叶绿素(a+b)质量分数在盐浓度为200 mmol·L-1时与对照相比显著下降(P<0.05)。盐浓度为400 mmol·L-1时，亲本及F1代总叶绿素质量分数分别是对照的37.67%、14.44%、34.92%、42.27%、26.44%、24.87%、19.39%。

表1 不同浓度NaCl胁迫时亲本及F1代的叶片叶绿素质量分数

2.2 NaCl胁迫对亲本及F1代光合参数的影响

NaCl胁迫下，野菊的Pn随着胁迫浓度的增大呈先上升后下降的趋势(见表2)，且在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最大值，是对照的1.16倍，与对照相比有显著差异(P<0.05)。神农香菊及F1代的Pn随着胁迫浓度的升高均呈下降趋势，且NaCl浓度为100 mmol·L-1时与对照差异显著(P<0.05)。当NaCl浓度为400 mmol·L-1时，Pn最高的是野菊，最低的是Z5。

亲本及F1代的Gs变化趋势与Pn基本一致(见表2)。野菊在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最大值，与对照相比无显著差异(P>0.05)。神农香菊及F1代Gs均呈下降趋势，且各处理组与对照相比差异显著(P<0.05)。

NaCl胁迫后亲本及F1代的Ci呈现相同的变化趋势(见表2)。亲本及F1代的Ci随着NaCl浓度的增大呈先下降后上升的趋势，野菊、Z3的Ci在NaCl浓度为200 mmol·L-1时达到最低，神农香菊及其余F1代株系在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最低。NaCl浓度为100 mmol·L-1时，Z1、Z2、Z4、Z5与对照相比达到显著差异水平(P<0.05)，NaCl浓度为200 mmol·L-1时，野菊、Z3与对照差异显著(P<0.05)。

亲本及F1代Tr随NaCl胁迫浓度的增大呈下降趋势(见表2)，各处理组与相应对照相比差异达显著水平(P<0.05)。NaCl浓度为400 mmol·L-1时，亲本及F1代蒸腾速率分别是对照的27.87%、17.18%、24.07%、29.80%、22.49%、18.27%、14.65%。

随着NaCl胁迫浓度的升高，亲本及F1代的WUE均呈现先上升后下降的趋势(见表2)，除神农香菊的WUE在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最大值，野菊及其余F1代株系的WUE均在NaCl浓度为200 mmol·L-1时达到最大值。NaCl浓度为100 mmol·L-1时，野菊、神农香菊与对照相比差异显著(P<0.05)；NaCl浓度为200 mmol·L-1时，Z2、Z3、Z4与对照相比差异显著(P<0.05)；NaCl浓度为400 mmol·L-1时，Z1、Z5与对照相比差异显著(P<0.05)。

表2 不同浓度NaCl胁迫时亲本及F1代的光合参数

续(表2)

2.3 NaCl胁迫对亲本及F1代叶绿素荧光参数的影响

由Fv/Fm的变化可推断反应中心的变化情况[17]。随着NaCl胁迫浓度的升高，亲本及F1代的Fv/Fm逐渐下降(见表3)。在NaCl浓度为100 mmol·L-1时，神农香菊、Z1、Z2的Fv/Fm与对照相比差异不显著(P>0.05)，仅有小幅度下降，野菊及其余F1代株系与对照差异显著(P<0.05)；NaCl浓度为200 mmol·L-1时，亲本及F1代的Fv/Fm均与对照达到显著差异水平(P<0.05)；NaCl浓度为400 mmol·L-1时，亲本及F1代的Fv/Fm分别是对照的74.39%、64.56%、75.00%、77.50%、70.00%、63.29%、53.75%，其中Fv/Fm最高的是野菊，最低的是Z5。

图1 不同NaCl浓度胁迫时野菊亲本及F1代的Fv/Fm

Fv/F0是PSⅡ的潜在光化学效率[18]。NaCl胁迫后亲本及F1代的Fv/F0与Fv/Fm呈现相同的变化趋势(见表3)。在NaCl浓度为100 mmol·L-1时，亲本及F1代的Fv/F0与对照相比差异显著(P<0.05)。NaCl浓度为400 mmol·L-1时，亲本及F1代的Fv/F0分别是对照的34.79%、27.61%、36.56%、38.82%、31.40%、26.91%、19.07%。

qP表示PSⅡ反应中心的开放程度，其值的大小与PSⅡ的电子传递活性呈正比[19]。亲本及F1代的qP变化趋势与Fv/Fm基本一致(见表3)，随着NaCl胁迫浓度的升高，亲本及F1代的qP逐渐下降。野菊、M、Z5的qP在NaCl浓度为100 mmol·L-1时与对照差异显著(P<0.05)，Z4的qP在NaCl浓度为400 mmol·L-1时与对照差异显著(P<0.05)。

ΦPSⅡ反映PSⅡ实际光化学效率[20]。随着NaCl胁迫浓度的升高，野菊的ΦPSⅡ呈先上升后下降的趋势(见表3)，且在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最大值，神农香菊及F1代均逐渐下降。野菊的ΦPSⅡ在NaCl浓度为100 mmol·L-1时与对照达到显著差异水平(P<0.05)，是对照的1.11倍。Z5的ΦPSⅡ在NaCl浓度为100 mmol·L-1时与对照达到显著差异水平(P<0.05)，神农香菊及其余F1代株系均在NaCl浓度为200 mmol·L-1时与对照达到显著差异水平(P<0.05)。

NPQ反映植物耗散过剩时光能转化为热能的能力[21]。亲本及F1代的NPQ均随着胁迫浓度的升高呈先上升后下降的趋势(见表3)，除野菊、Z1、Z3在NaCl浓度为200 mmol·L-1时达到最大值，神农香菊及其余F1代株系均在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最大值。

表3 不同浓度NaCl胁迫时不同株系的叶绿素荧光参数

2.4 各生理指标的相关性

对亲本及F1代在NaCl胁迫后的各项指标进行相关性分析，得到相关系数矩阵。从表4可以看出，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)质量分数、光合参数(Pn、Gs、Ci、Tr、WUE)、叶绿素荧光参数(Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、NPQ、qP)之间普遍存在显著正相关关系(P<0.05)，需要注意的是，叶绿素a与Gs和WUE之间无显著相关性(P>0.05)。3类性状内部彼此之间也存在着显著相关性，即叶绿素a与叶绿素(a+b)极显著正相关(P<0.01)，Pn与Ci、Tr、WUE极显著相关(P<0.01)，Fv/Fm与NPQ、qP极显著正相关(P<0.01)。

2.5 各生理指标的主成分分析

由上述分析可知，各处理之间存在普遍相关性，因此可对试验材料在4个试验处理下的13个指标进行主成分分析，提取出2个主成分荷载(见表5)，其特征值分别为8.126、3.582，累计方差贡献率达到90.06%，符合分析要求。第1主成分与Fv/F0、Tr、Gs、Fv/Fm、叶绿素b、叶绿素(a+b)、叶绿素a、Pn、ΦPSⅡ、qP等指标高度正相关，成分荷载均达0.750以上。第2主成分与WUE、NPQ正相关，成分荷载分别为0.932、0.891，与Ci负相关，成分荷载为-0.722。

表4 NaCl胁迫时不同株系各指标间的相关性

表5 各测定指标主成分分析旋转后的成分载荷矩阵

根据主成分分析法计算因子得分，以因子1为横轴，因子2为纵轴做分析图[22](见图2)。由图2可知，亲本及F1代在同种处理下所处的空间位置大致相同，在对照组中，亲本及F1代集中分布在主成分轴1正向两侧；NaCl浓度为100 mmol·L-1时，亲本及F1代零散分布于主成分轴2正向两侧；NaCl浓度为200 mmol·L-1时，亲本及F1代零散分布于主成分轴1负向与主成分轴2正向之间；NaCl浓度为400 mmol·L-1时，亲本及F1代零散分布于主成分轴1负向与主成分轴2负向之间。同一株系从对照组到各处理组的位移方向基本一致，但位移量不同，即同一植株对不同浓度的NaCl的响应方式大致相同，但程度上有差别；亲本及不同F1代株系从对照组到各处理组的位移差异较大，说明亲本及不同F1代株系对NaCl的反应方式不同。

2.6 各株系耐盐性的综合评价

用隶属函数法对亲本及F1代进行耐盐性综合评价。由表6可知，野菊耐盐性最强，Z1、Z2耐盐性相差不大。亲本及F1代耐盐性从高到低依次为野菊、Z2、Z1、Z3、Z4、Z5、神农香菊。

图2 不同NaCl浓度处理时各株系空间位移

表6 NaCI胁迫时不同株系各指标的隶属函数值

3 结论与讨论

叶绿素是主要的光合色素，是植物进行光合作用的重要物质，其含量可以反映植物光合能力的大小，可以作为衡量植物对盐胁迫耐受能力的关键指标之一[23]。本试验中，亲本及F1代的叶绿素质量分数随NaCl胁迫浓度的升高逐步下降，且NaCl浓度越高，叶绿素质量浓度下降幅度越大，与张利霞等[24]的研究结果一致，原因可能在于，NaCl提高了叶绿素酶的活性，加快叶绿素的分解，最终导致叶绿素质量分数的下降。研究表明，叶绿素酶主要催化叶绿素b的降解，对叶绿素a有一定降解作用但影响较小[25]，神农香菊、Z3、Z4、Z5的叶绿素b质量浓度在低浓度NaCl胁迫时显著下降，可能是由于叶绿素酶起主要作用；另一个原因可能在于盐胁迫下植物对活性氧的淬灭能力变弱，使活性氧自由基增加，进一步加速叶绿素的降解[26]。

光合作用是反映植物响应盐胁迫的重要生理指标之一[27]。研究表明，植物光合作用下降的原因主要有气孔限制和非气孔限制，Gs是影响低盐胁迫下Pn降低的主要原因，非气孔限制则是高盐胁迫下Pn降低的主要原因[28]。随着NaCl浓度的增大，亲本及F1代的Pn、Gs、Tr整体上均呈降低趋势，Ci呈先下降后上升趋势。研究表明，Ci、Gs同时降低表示Pn的降低是由气孔因素导致的[29]，说明在低浓度NaCl处理中，气孔导度可能在亲本及F1代叶片Pn降低过程中占主导作用，这与贾旭梅等[30]的研究结果一致；Ci先降后升，表明随着NaCl浓度的增大，Pn降低的主导原因由气孔因素过渡到非气孔因素，即叶绿素质量分数降低、类囊体膜受损或叶肉细胞的光化学活性降低等因素使植物光合作用CO2利用率降低所致[31]。在本试验中，野菊、Z3的Ci在NaCl浓度为200 mmol·L-1时达到最低，神农香菊及其余F1株系在NaCl浓度为100 mmol·L-1时达到最低，这说明在盐胁迫下野菊、Z3具有更好的非气孔因素稳态。相关性分析表明，Pn与Gs、Tr呈极显著正相关(P<0.01)，这表明Gs、Tr的降低是亲本及F1代响应NaCl胁迫过程中的重要机制。亲本及F1代的WUE均呈先上升后下降趋势，WUE下降的原因可能是由于Gs降低导致Tr下降的速度快于Pn，植物通过降低WUE的方式来维持自身生长发育[32]，神农香菊的WUE在NaCl浓度为100 mmol·L-1时即达到最大值，这说明神农香菊在低NaCl浓度胁迫下光合作用已受到较大伤害，需要改变自身光合作用水分利用效率应对盐胁迫。

植物叶片进行光合作用时吸收的光能主要通过叶绿素荧光、光化学反应和热耗散这3种方式消散掉，3种途径之间联系紧密、相互作用[33-34]。叶绿素荧光参数的变化，在一定程度上能反映出植物在遇到环境胁迫时做出的反应，与光合参数相比，叶绿素荧光参数能更好地反映植物光合作用的内在变化[35]。研究表明，在植物受到胁迫后，Fv/Fm降低表明叶片的PSⅡ反应中心遭到破坏，发生光抑制现象；ΦPSⅡ、qP降低表明胁迫降低了PSⅡ反应中心原初光捕捉效率，使PSⅡ电子传递受阻，从而影响实际光合效率[36]。随着NaCl浓度的增大，亲本及F1代的Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、qP整体上呈下降趋势，且显著(P<0.05)低于对照，说明盐胁迫破坏了亲本及F1代的光合系统，抑制了光合电子传递活性，降低了光能利用率，但不同的是，野菊、Z1、Z2下降幅度较小，在盐胁迫下表现出更高的光能利用效率；NPQ随着NaCl浓度的增大呈先上升后下降趋势，表明随NaCl浓度的增大，亲本及F1代启动了热能量耗散机制，并通过非光化学淬灭以热形式耗散激发能来适应胁迫环境。其中野菊、Z1、Z3在200 mmol·L-1NaCl胁迫下达到最大值，而神农香菊及其他F1代株系在100 mmol·L-1NaCl胁迫下达到最大值，表明野菊、Z1、Z3启动热耗散保护机制晚于神农香菊及其他F1代株系，对盐胁迫的抗性更好。相关性分析表明，Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ与Pn呈极显著正相关(P<0.01)，qP、NPQ与Pn呈显著正相关(P<0.05)，说明Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ与光合作用密切相关，其变化趋势是判断植物耐盐能力的重要指标。

植物的耐盐性与多个因素相关，指标单一化难以准确反映植物耐盐的实质，因此用多个指标对植物进行耐盐能力的综合评价是十分必要的。本试验以亲本及F1代的13个相关指标为依据，对其进行相关性、主成分及隶属函数分析。相关性分析表示，植物Pn与叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、Gs、Tr、Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ呈极显著正相关(P<0.01)，与WUE、qP、NPQ呈显著相关(P<0.05)，与Ci呈显著负相关(P<0.05)，因此可用以上指标来评价不同菊花株系的耐盐能力。第1主成分中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、Pn、Fv/F0、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP是损伤的重要指标，Tr、Gs是调节光合作用的重要指标，说明亲本及F1代主要通过降低Tr、Gs来适应盐胁迫；第2主成分中WUE是节水指标，NPQ是热耗散保护指标，说明亲本及F1代通过提高WUE、启动热耗散机制来抵御盐胁迫伤害。运用隶属函数对亲本及F1代耐盐性进行综合评价，耐盐性由强至弱依次为野菊、Z2、Z1、Z3、Z4、Z5、神农香菊。

综上，耐盐性强的植株表现出更高的光能利用效率，光合指标基本上相互关联，能综合反映本试验植物材料的耐盐能力，也为评价其他菊花耐盐性提供参考；野菊与神农香菊的杂交F1代芳香株系耐盐性均优于母本，这表明通过杂交可获得耐盐性改良的芳香菊花新品种，对培育芳香菊花耐盐株系，进行菊花种质创新和品质改良具有重要意义。