外周血TBNK淋巴细胞亚群和血清Th1/Th2细胞因子与不明原因复发性流产的相关性研究

杨攀玉 曲 婷 曾 莉 孟庆甜 罗成松 解梦媛 郑 渠（成都西囡妇科医院，成都610000）

胎儿相对于母体是同种半异体移植物，正常妊娠需要母体免疫系统对父方来源的胎儿组织发生免疫识别和产生免疫反应，建立起一个对胎儿局部免疫耐受环境，如果免疫微环境失调则会导致流产［1］。

美国生殖医学学会（ASRM）将复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）定义为与同一性伴侣连续发生2次或2次以上的自然流产，在育龄妇女中发生率为1%～5%，是当前妇产科医生及患者面临的一个相当棘手的问题［2］。目前已知的病因有遗传因素（父母双方染色体异常、流产物绒毛染色体检查异常等）、解剖因素（子宫畸形、宫腔黏连、子宫内膜息肉、子宫肌瘤等）、感染因素（衣原体感染、病毒感染等）、内分泌因素（甲状腺功能异常、多囊卵巢综合征、胰岛素分泌异常、高泌乳素血症等）和自身免疫病（抗磷脂抗体综合征、未分化结缔组织病、红斑狼疮等），除此之外仍有50%～60%的患者无法找到明确的病因，定义为原因不明的复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［3-4］。多年来，由于检测方法缺乏、治疗手段有限，URSA保胎成功率非常低。近年来，随着对URSA病因的深入探究，人们逐渐意识到80%左右的URSA可能与免疫功能异常相关［5］。目前，虽然RSA的机制已成为国内外的研究热点，但大多是针对淋巴细胞亚群比率与流产的相关性研究，例如胡道琴等［6］研究复发性流产患者淋巴治疗前后T淋巴细胞亚群比率的变化。毛立群等［7］研究RSA患者外周血T淋巴细胞亚群及CD4+辅助性T淋巴细胞比率的变化等，研究因素相对单一。而对于Th1/Th2细胞因子的流产机制，国内大多用传统的ELISA技术进行检测，例如赵静［8］通过采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测72例URSA患者和30例正常妇女的外周血Th1和Th2细胞因子水平来研究复发性流产患者Th1/Th2细胞因子的失衡机制。陈广莉等［9］也是采用ELISA技术研究URSA患者血清Th1（TNF-α）和Th2（IL-6）水平变化等。而本研究通过运用先进的流式技术同时检测URSA病例组和正常对照组的淋巴细胞亚群和人Th1/Th2细胞因子的含量，探讨URSA患者相对于正常对照女性在淋巴细胞和免疫学细胞因子方面的差异。同时正常妊娠URSA患者作为自身对照，比较临床治疗，妊娠前后自身淋巴细胞亚群和Th1/Th2细胞因子的变化。随访URSA患者根据不同的妊娠结局对URSA患者进行分组，对其外周血TBNK淋巴亚群和Th1/Th2细胞因子的结果进行统计学的数据分析，从而探讨URSA患者的发病机制，为临床诊断和防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 URSA病例组：选择2018年5月至2019年5月成都西囡妇科医院就诊的60例URSA患者，同时具备以下条件：①既往连续发生2次或2次以上自然流产，年龄20～35岁，平均年龄（27.02±3.1）岁，流产史均为早期流产（孕20周以内）；②夫妻双方染色体正常；③男方精液常规检查正常，且衣原体，支原体，淋球菌检查阴性；④女方生殖道正常，无畸形；⑤女方阴道分泌物正常，无感染；⑥女方激素结果正常；⑦女方TORTCH结果正常；⑧女方未患有自身免疫病。排除遗传、男方因素、女方生殖道畸形、内分泌因素异常和感染、自身免疫病后的RSA患者称为URSA。正常对照组：同时选择2018年5月至2019年5月有健康分娩史的30例妇女作为正常对照组。同时满足以下条件①既往无不良孕产史，有1胎以上足月正常分娩史；②年龄20～35岁；平均年龄（28.30±2.96）岁。以上2组妇女年龄、体重指数、流产次数进行t检验比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.1.2 试剂与仪器 BD FacscantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司。CD3-FITC/CD16+CD56-PE/C D45-PerCP-Cy5.5/CD4-PC7/CD19-APC/CD8-APCCy7荧光单克隆抗体试剂盒（流式细胞仪法）和TSCell-Count绝对计数微球试剂盒均购自北京同生时代生物技术有限公司；人Th1/Th2亚群检测试剂盒（流式荧光法）购自杭州赛基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 随访计划及内容 随访40例URSA患者中22例经临床治疗和18例未经临床治疗后的妊娠结局。随访结果显示22例URSA患者经临床治疗后，正常妊娠且妊娠结局均为正常分娩，18例未经临床治疗再次妊娠后妊娠结局均为再次流产。流产组织送CMA（染色体芯片分析）检查，结果显示正常，排除染色体异常导致的流产。临床医生在再次妊娠前告知未经治疗的18例患者再次流产的风险，患者知情同意。

1.2.2 临床治疗 淋巴亚群异常患者若CD19+高的采用羟氯喹（200～400 mg/d）治疗，其他异常者均采用环孢素（25 mg po bid～25 mg po tid）治疗，细胞因子异常患者若IFN-γ高采用他克莫司，其他细胞因子异常者采用环孢素（25 mg po bid～25 mg po tid）；若淋巴亚群和细胞因子2项结果均异常的患者根据具体情况采用环孢素加他克莫司或环孢素加肿瘤坏死因子拮抗剂连用治疗，一般治疗周期为1个月，治疗后黄体期采血监测治疗效果，若指标未恢复正常者再加1个周期，待黄体期采血结果恢复正常为止。

1.2.3 标本采集和处理 ①淋巴细胞亚群及绝对值计数用EDTA抗凝全血，常温下保存，24 h以内检测；②细胞因子用有分离胶的黄头管分离血清，4℃冷藏保存，48 h以内检测；③URSA病例组和正常对照组淋巴亚群和细胞因子均为黄体期采血，随访22例正常妊娠URSA患者（妊娠结局正常分娩）治疗后孕前黄体期，孕后4周、8周、12周、16周分别采集淋巴亚群和细胞因子标本进行检测，18例再次流产患者，孕后（至流产前）与正常妊娠患者同一时间采集淋巴亚群和细胞因子进行检测。

1.2.4 淋巴细胞亚群检测 ①标本的准备：取出冰箱试剂，恢复至室温。将采集好的EDTA抗凝全血样本编号，如1，以此类推，并扫入相应的LIS系统，核对信息无误后，准备好对应数量的淋巴绝对计数管，对应标号；②吸取50μl混匀的EDTA抗凝全血，加入绝对计数微球管底部，移液器前端避免接触管底（避免带出微球，影响淋巴亚群的绝对计数），同时避免血液碰到管壁上部；③在已加样本的微球管底部加入20μl的荧光抗体试剂。注意将枪头接触靠近微球的管壁快速打入，避免带出血液影响绝对值计数；④充分涡动混匀约10 s，室温避光反应20 min；⑤向管内加入450μl溶血剂，室温避光反应10 min；⑥加入450μl磷酸缓冲液（PBS），上机检测。按照标本标号依次放置于转盘内，在样本后准备两个流式上样管，分别加入2 ml HClO和3 ml蒸馏水，将装有HClO的管子放在紧接样本的位置。蒸馏水的管子放在最后一个位置。点击开始，临床软件自动化操作；⑦结果处理：在CD45/SSC散点图中圈出CD45高表达，SSC低表达的淋巴细胞群。然后再分别手动选择CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、CD19+细胞群，如图1。

1.2.5 细胞因子检测方法 采用流式CBA（多重蛋白定量检测）技术。①标本准备：取出冰箱试剂，恢复至室温，将检测样本编号，如1，以此类推，并扫入相应的LIS（成都信通实验室信息）系统，核对信息无误后，准备好对应数量的流式上样管，对应标号；②计算样本数量n（n=标准品管数10+检测样本数量）；③取试剂盒捕获微球混合液（A），漩涡振荡3～5 s，取n*25μl（可适当多取）于试管中并标记，200 g离心5 min后用移液枪小心吸取上清弃掉，再取等量微球缓冲液（H）重悬微球。漩涡振荡3～5 s后避光孵育30 min；④从试剂盒中取出标准品管（B），转移至试管后加入2 ml样本稀释液后静置15 min，并标记为最高标准品浓度（注意动作轻柔，请勿剧烈振荡）；⑤取10只试管，分别标记为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512，每管分别加入300μl样品稀释液（G）；⑥从最高浓度标准品管中吸取300μl样本至1∶2管，轻轻吹打混匀20次，再从1∶2管中取300μl样品至1∶4管，吹打混匀，如此类推，直到1∶512管。⑦取n只上样管，依次标记为标准品管：0（记为阴性对照）、1、2、……10，样本管：test1、test2……test（n-11）其中标准品管浓度对应关系见表1；⑧将孵育好的捕获微球振荡混匀后，向标准品管中加入25μl对应浓度的标准品，样本管中各加25μl待检测样本，向所有标准品管及样品管中分别加入25μl荧光检测试（C）；⑨所有上样管振荡混匀，室温避光孵育2.5 h。孵育完成后，每管加入1 ml PBS溶液洗涤，200 g离心5 min，弃上清。每管加入100μl PBS溶液，振荡重悬后上机。上机后软件自动分析数据。

图1 淋巴细胞亚群检测结果处理图Fig.1 Processing chart of lymphocyte subsets detection results

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本和配对样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 URSA病例组和正常对照组比较 URSA病例组外周血的Th细胞（CD4+及CD4+/CD8+），B细胞（CD19+）以及NK细胞（CD16+CD56+）比例和绝对值计数结果均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而CD8+和CD3+细胞百分率和绝对值计数结果无统计学差异（P＞0.05）；URSA患者外周血Th1/Th2细胞因子中的TNF-α、IFN-γ和IL-6均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而细胞因子IL-2、IL-4和IL-10差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、3。

2.2 比较正常妊娠组和再次流产组URSA患者的TBNK淋巴亚群和Th1/Th2细胞因子 根据URSA患者再次妊娠的妊娠结局进行分组（正常妊娠组和再次流产组），再次流产URSA患者外周血的Th细胞，B细胞以及NK细胞比例和绝对值计数结果均高于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05），而CD8+和CD3+细胞百分率和绝对值计数结果在不同妊娠结局患者中无统计学差异（P＞0.05）；同时再次流产URSA患者外周血Th1/Th2细胞因子中的TNF-α、IFN-γ和IL-6均高于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05），而细胞因子IL-2、IL-4和IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表4、5。

表1 细胞因子标准品管浓度对应关系表Tab.1 Correspondence table of cytokine standard quality control concentration

表2 URSA病例组和正常对照组淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，n=60，%，cells/μl）Tab.2 Comparison of lymphocyte subsets ratio and level of absolute count between URSA group and normal control group（±s，n=60，%，cells/μl）

表2 URSA病例组和正常对照组淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，n=60，%，cells/μl）Tab.2 Comparison of lymphocyte subsets ratio and level of absolute count between URSA group and normal control group（±s，n=60，%，cells/μl）

Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+CD16+CD56+CD16+CD56+URSA case 70.05±6.20 1 025±92 55.92±5.28 1 120±35 29.02±3.29 485±72 1.85±0.29 25±2.30 382±56 28±4.60 359±76 Normal control P 68.92±5.90＞0.05 989±86＞0.05 32.89±4.26＜0.05 725±18＜0.05 28.96±3.00＞0.05 479±89＞0.05 1.10±0.30＜0.05 16±3.20＜0.05 253±49＜0.05 18±3.20＜0.05 159±39＜0.05

表3 URSA组和正常对照组外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，n=60，pg/ml）Tab.3 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood between URSA group and normal control group（±s，n=60，pg/ml）

表3 URSA组和正常对照组外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，n=60，pg/ml）Tab.3 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood between URSA group and normal control group（±s，n=60，pg/ml）

Groups URSA case IL-2 3.25±1.50 TNF-α 20.36±3.20 IFN-γ 18.26±2.50 IL-4 2.69±0.50 IL-6 25.26±1.60 IL-10 2.80±0.70 Normal control 3.19±1.10 1.90±0.20 5.20±1.50 3.20±0.60 3.52±1.30 3.69±0.80 P ＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05

2.3 正常妊娠URSA患者治疗前后变化 结果显示治疗后与正常妊娠后患者外周血Th细胞，B细胞以及NK细胞比例和绝对值计数结果均比未治疗妊娠前有所明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；CD8+和CD3+细胞百分率和绝对值计数结果无统计学差异（P＞0.05）。同时，治疗后与妊娠后外周血Th1/Th2细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6均比未治疗妊娠前有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而细胞因子IL-2、IL-4和IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表6、7。

表4 不同结局妊娠结局URSA患者间外周血淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，%，cells/μl）Tab.4 Comparison of rat and absolute value of peripheral blood lymph subsets among URSA patients with different pregnancy outcome（±s，%，cells/μl）

表4 不同结局妊娠结局URSA患者间外周血淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，%，cells/μl）Tab.4 Comparison of rat and absolute value of peripheral blood lymph subsets among URSA patients with different pregnancy outcome（±s，%，cells/μl）

Note：Resultsof blood samplingin same gestational week between recurrent abortion group and thenormal pregnancy group.

CD16+CD56+372±58 132±41＜0.05 Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+Abortion（n=18）Normal pregnancy（n=22）P 67.05±4.90 68.92±5.90＞0.05 972±86 999±86＞0.05 62.92±5.08 38.89±3.99＜0.05 1 256±39 785±20＜0.05 26.02±3.20 27.96±3.21＞0.05 475±62 462±79＞0.05 1.98±0.31 1.08±0.29＜0.05 28±1.90 16±3.00＜0.05 395±42 242±39＜0.05 CD16+CD56+35±4.00 17±3.50＜0.05

表5 不同结局妊娠结局URSA间外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，pg/ml）Tab.5 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA with different pregnancy outcome（±s，pg/ml）

表5 不同结局妊娠结局URSA间外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，pg/ml）Tab.5 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA with different pregnancy outcome（±s，pg/ml）

Note：Results of blood sampling in the same gestational week between the abortion group and the normal pregnancy group.

IL-10 2.68±0.80 3.48±0.80＞0.05 Groups Abortion（n=18）Normal pregnancy（n=22）P IL-2 3.85±1.00 3.00±1.50＞0.05 TNF-α 29.56±2.50 0.90±0.30＜0.05 IFN-γ 25.26±3.20 3.20±1.00＜0.05 IL-4 3.02±0.60 3.32±0.60＞0.05 IL-6 25.32±2.00 3.02±1.00＜0.05

表6 正常妊娠URSA患者治疗前后和妊娠后外周血淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，%，n=22，cells/μl）Tab.6 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets and level of absolute count before and after treatment in URSA patients with normal pregnancy（±s，%，n=22，cells/μl）

表6 正常妊娠URSA患者治疗前后和妊娠后外周血淋巴亚群比例及绝对值计数水平比较（±s，%，n=22，cells/μl）Tab.6 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets and level of absolute count before and after treatment in URSA patients with normal pregnancy（±s，%，n=22，cells/μl）

Note：P1 valueswasbeforetreatment compared with after treatment.Valueof P2 wasbeforetreatment compared with after normal pregnancy.

CD16+CD56+369±59 140±45 132±41＜0.05＜0.05 Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+Before treatment After treatment After pregnancy P1 P2 69.05±5.20 68.85±4.90 68.92±5.90＞0.05＞0.05 989±90 992±78 999±86＞0.05＞0.05 58.92±5.08 36.54±4.02 38.89±3.99＜0.05＜0.05 1 100±40 779±18 785±20＜0.05＜0.05 28.02±3.59 28.96±3.02 27.96±3.21＞0.05＞0.05 CD3+CD8+470±62 465±69 462±79＞0.05＞0.05 1.92±0.31 1.10±0.25 1.08±0.29＜0.05＜0.05 25±2.10 14±3.50 16±3.00＜0.05＜0.05 384±50 239±40 242±39＜0.05＜0.05 CD16+CD56+29±4.00 15±3.60 17±3.50＜0.05＜0.05

表7 正常妊娠URSA患者治疗前后和妊娠后外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，n=22，pg/ml）Tab.7 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA patients with normal pregnancy before and after treatment（±s，n=22，pg/ml）

表7 正常妊娠URSA患者治疗前后和妊娠后外周血Th1/Th2细胞因子比较（±s，n=22，pg/ml）Tab.7 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA patients with normal pregnancy before and after treatment（±s，n=22，pg/ml）

Note：P1 wasbeforetreatment compared and after treatment；P2 valuewascomparison between beforetreatment and after normal pregnancy.

IL-10 2.78±0.70 2.89±0.90 3.32±0.80＞0.05＞0.05 Groups Before treatment After treatment After pregnancy P1 P2 IL-2 3.15±1.60 3.05±1.50 3.00±1.50＞0.05＞0.05 TNF-α 22.56±2.50 1.00±0.20 0.90±0.30＜0.05＜0.05 IFN-γ 19.26±2.30 2.95±0.94 3.20±1.00＜0.05＜0.05 IL-4 2.68±0.50 2.80±0.60 3.31±0.60＞0.05＞0.05 IL-6 23.82±1.30 4.02±0.96 3.02±1.00＜0.05＜0.05

3 讨论

妊娠的免疫机制：妊娠是一个复杂的生理过程，生殖免疫学观点认为，妊娠是一种同种半异体移植的现象，正常妊娠取决于母胎免疫系统间精确的动态平衡。但如果母胎双方免疫平衡被打破，则会引起母体对胎儿的排斥而发生流产［10］。目前，国内外研究表明，URSA主要与免疫因素有关，母胎界面的免疫耐受维持正常胚胎不被母体排斥，一旦打破这种平衡状态，将会导致URSA的发生［11-12］。

淋巴亚群与URSA的相关讨论：成熟的T淋巴细胞表面均可表达CD3+分子，并可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两个亚群，其中CD4+T细胞属于辅助性/诱导性T淋巴细胞，介导细胞免疫，其比率和绝对值增加可使母体细胞免疫功能增强，对胚胎的免疫排斥反应增强，导致妊娠不能继续。CD8+T细胞属于杀伤性/抑制性T淋巴细胞，它既可抑制由B淋巴细胞介导的体液免疫，也可抑制CD4+T细胞介导的迟发性超敏反应及增殖反应等，从而保证胚胎半同种抗原不被排斥［13］。本研究显示URSA病例组CD4+T、CD4+T/CD8+T均较健康分娩正常对照组高（P＜0.05），在URSA患者治疗后与正常妊娠后CD4+T、CD4+T/CD8+T均比未治疗前有所明显下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠结局比对中，再次流产组CD4+T、CD4+T/CD8+T均高于正常妊娠组（P＜0.05），以上结果都体现了CD4+T、CD4+T/CD8+T随不同妊娠结局的变化规律，进一步证实了CD4+T、CD4+T/CD8+T的异常增高与流产相关，对妊娠不利。

外周血NK细胞根据细胞膜表面标记可分为CD16+CD56+，CD16-CD56+。CD16+CD56+细胞含有溶细胞颗粒，对胚胎起免疫杀伤和排斥作用，CD16-CD56+不含有溶细胞颗粒，能产生多种细胞因子，对胚胎起免疫保护和营养作用［14］。KIM等［15］研究发现，URSA患者与正常妇女中外周血NK细胞在妊娠前后并无明显改变，具体分析NK细胞亚群，发现URSA患者外周血CD56+CD16+NK细胞明显升高［16］。有研究表明URSA患者无论是外周血，黄体期内膜还是子宫蜕膜组织中CD56+CDl6+均增高［17］。本实验采用CD3-CD16+CD56+标记NK细胞，研究结果显示URSA病例组外周血CD56+CD16+NK细胞较健康分娩正常对照组高（P＜0.05），在URSA患者治疗后与正常妊娠后CD56+CD16+NK细胞比未治疗前有明显下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠结局比对中，再次流产组CD56+CD16+NK细胞明显高于正常妊娠组（P＜0.05），说明了CD56+CD16+NK细胞异常增高对胚胎产生杀伤作用从而导致流产的发生，结论与上述研究结果一致。

CD19+淋巴细胞又称为成熟B淋巴细胞，表示人体体液免疫功能的状态。相关的研究资料结果显示URSA患者其外周血液中的CD19+表达量会相对更高，但是目前在该方面意见还未达成一致［18］。梁逸仙等［19］结果发现有URSA病史或者难免会出现流产的孕妇其血样中的CD19+表达量相较于正常妊娠或者正常女性的表达量明显较高（P＜0.05）。本研究结果显示URSA病例组CD19+较健康分娩正常对照组高（P＜0.05），URSA患者治疗后和正常妊娠后CD19+比未治疗前明显下降（P＜0.05）。URSA患者不同妊娠结局比对中，再次流产组CD19+明显高于正常妊娠组（P＜0.05），说明患者体内CD19+异常升高导致流产的发生，说明可能过多的B细胞产生过多的自身抗体导致自身免疫系统紊乱，自身抗体攻击胚胎，导致流产的发生。

人Th1/Th2细胞因子与复发性流产的相关性：现代生殖免疫学认为，妊娠是一种成功的半同种移植现象，而妊娠是否成功有赖于母胎间的相互作用，既要避免胎儿被母体排斥，又要防止过度入侵，这在很大程度上取决于Th1/Th2细胞因子的动态平衡［20］。CD4+T细胞又称为辅助性T细胞，是人体内T细胞的一个亚群，在妊娠免疫中发挥重要的作用，CD4+T细胞可根据其分泌细胞因子的功能不同，可分为Th1和Th2两亚群，其中Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，Th1型细胞因子主要介导细胞免疫反应，促进巨噬细胞活化，产生细胞毒作用，从而产生胚胎排斥作用。Th2细胞主要分IL-4、IL-6和IL-10，主要介导体液免疫反应，促进嗜酸细胞和肥大细胞分化，抑制免疫炎症，减少过度损伤，具有免疫营养作用，从而形成免疫耐受保护，使胚胎不受母体免疫系统的排斥［21-22］。在正常条件下，Th1/Th2的比例维持在一定范围，任何一方的增多或减少都可能使原有的比例发生偏移。研究发现，母体在妊娠期间细胞免疫功能受抑制，体液免疫功能增强，Th1/Th2细胞比值向Th2细胞方向偏移，Th2细胞优势环境对妊娠有利，而Th1细胞因子对妊娠有害，可导致不良妊娠［23］。

据研究报道，外周血Th1细胞因子INF-α、IFN-γ和IL-2等的作用是造成妊娠丢失的主要原因之一［24］。沈茜等［25］研究发现URSA组外周血IL-4、IL-6和IL-10较正常妊娠组低，证明Th2型细胞因子是正常妊娠时必需的。本文通过应用先进的流式CBA技术探讨Th1/Th2细胞因子与复发性流产相关性结果可得，URSA组INF-α、IFN-γ和IL-6较健康分娩正常对照组高（P＜0.05），在URSA患者治疗后和正常妊娠后INF-α、IFN-γ和IL-6比未治疗前有明显下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠结局比对中，再次流产组INF-α、IFN-γ和IL-6明显高于正常妊娠组（P＜0.05），而IL-2、IL-4和IL-10在3个组间均无显著性差异（P＞0.05）。本研究结果中INF-α和IFN-γ是Th1型细胞因子，与报道结果一致，但IL-2、IL-4、IL-6和IL-10与报道结果不一致。首先，IL-2在3组间比较无显著性差异，本研究组认为IL-2高的患者较为少见，由于本文研究纳入样本数量有限，造成差异存在。Th2型细胞因子IL-4和IL-10在3组间比对无显著性差异，这一点，本课题组认为外周血细胞因子的参考值本来就很低，而实验所用的试剂检测线范围为2.5～5 000 pg/ml，所以低于2.5 pg/ml是无法检测出具体数值的，因此即使URSA病例组患者IL-4和IL-10的值低于正常对照组或者再次流产组URSA患者IL-4和IL-10值低于正常妊娠组URSA患者，根据本实验运用的方法学检测范围局限也无法得出显著性差异。IL-6作为Th2细胞因子，URSA病例组患者明显高于正常对照组与上述研究结果不符，也与国内大多数研究报道的结果不一致。国内大多数报道Th1/Th2细胞因子与RSA相关性研究时采用ELISA，如邵剑春等［26］通过ELISA技术研究发现外周血中IL-6水平复发性流产患者亦明显低于正常妊娠妇女。如赵爱民等［27］通过采用ELISA技术检测自然流产小鼠模型外周血Th1/Th2型细胞因子探讨Th1/Th2细胞因子与复发性流产的相关性等，均与本研究采用的方法不一样。近年来，流式细胞分析术已广泛应用于临床。流式微球分析技术所需样本量少，并大大缩短操作时间，同时其特异性强，灵敏度高，如果将多种荧光强度具有明显差异的微球，分别耦联不同特异性的抗体，各种微球按比例混合，可对样本中多种可溶性细胞因子或蛋白质同时进行多参数联合检测［28］。令狐颖等［29］通过对自建IL-6、TNF-α和MCP-1的流式微球联合检测方法进行评价，证实CBA技术具有高通量、高敏感、重复性好、线性范围宽、准确度高、抗干扰性好等优点，对拓展流式细胞分析技术、延伸流式细胞仪应用领域，有着积极的作用。李如林等［30］通过ELISA、流式微球载体技术检测梅毒抗体的比较得出流式微球载体技术的灵敏度（100%）优于ELISA（96%）。ELISA法导致假阴性的原因与检测方法的灵敏度有关。尽管流式微球载体技术依赖流式细胞仪，但该技术在试验和临床研究上具有潜在价值［31-32］。其次，IL-6是Th2型的细胞因子，能刺激B细胞产生抗体，刺激CTL分化，增强GM-CSF活性，促进黏附分子生成，在滋养细胞的增殖、入侵和分化及胎盘血管的形成中起重要作用，可下调细胞介导的免疫反应，抑制母体排斥反应，有利于维持妊娠［33］。另一方面，IL-6在自然状态下具有抗炎的作用，有利于妊娠，陈广莉等［34］研究结果显示IL-6在URSA患者中显著高于对照组，认为IL-6水平的升高可能导致免疫耐受和抗炎作用的失衡，同样可以导致反复流产的发生。与本研究结果一致。IL-6既然能刺激B细胞产生抗体，那么显著增高的IL-6可能会使机体产生过多的自身抗体导致自身免疫系统紊乱，过多的自身抗体攻击胚胎，会导致流产的发生，这说明IL-6在RSA患者体内的免疫作用并不是单方面的，可能同时具有多方面作用，各种作用结果的一致性和拮抗性不同可能导致不同的妊娠结局。这可能是本文的研究与大多数文献研究IL-6的结论不一致的原因。介于本研究的实验样本数目相对较少，所以具体的免疫机制还有待做更进一步的深入研究。

本研究相比国内大部分文献的优点在于：①本研究不仅把URSA病例患者与健康分娩史的正常对照组做比较，同时还随访其中40例URSA患者中，将其中正常妊娠的URSA患者妊娠前后对比，以及再次流产URSA患者与正常妊娠URSA患者结果比较，阐述了同一患者在妊娠阶段和流产阶段外周血TBNK淋巴亚群与Th1/Th2细胞因子的变化。进一步证实了体内淋巴亚群（CD4+、CD19+和CD16+CD56+）和细胞因子（INF-α、IFN-γ和IL-6）的异常增高将导致流产的发生，不利于妊娠；②本研究淋巴细胞亚群与URSA患者关系的优点在于同时检测了淋巴细胞亚群的比例和绝对值计数，且两者结果相符合；③相比较大多数文献本文不仅研究淋巴细胞亚群或Th1/Th2细胞因子与复发性流产的相关性，并且研究两者与URSA的关系，为临床的诊断治疗提供了可靠的依据；④本研究与国内大部分文献研究Th1/Th2细胞因子所用的方法不同，大部分文献均采用传统的ELISA技术，而本研究运用了先进的流式CBA技术定量检测外周血Th1/Th2细胞因子。希望还能有更多的学者来针对这2个因素在RSA患者体内具体的免疫作用做更加深入的研究，尤其是IL-6在URSA患者体内的具体调节机制，为临床提供更加准确可靠的诊断依据。