MiRNA-21通过Erk信号通路调节视网膜色素上皮细胞的增殖侵袭和凋亡冯婷婷

何广辉 董蒙 武斌 梁泽玉 陈松

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)位于视网膜结构的最外层，由单层规律排列的RPE细胞组成，在维持视网膜功能方面起着至关重要的作用。此外，RPE细胞还具有光吸收、光氧化保护、吞噬脱落的光感受器细胞膜盘以及参与离子和液体转运等功能[1]。临床上，一些严重影响视力的眼科疾病，例如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)[2]和视网膜色素变性(retinal pigmentosa,RP)[3]等的发生、进展都与RPE细胞的退行性改变有关。RPE细胞在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的发病机理中起着重要作用[4-8]，PVR的过程涉及许多类型的细胞，包括成纤维细胞，神经胶质细胞和巨噬细胞，尤其是RPE细胞。相关研究表明，PVR的产生与RPE细胞的增殖与迁移状态发生变化有关[7]。目前，一些抑制RPE细胞增殖和凋亡的药物已用于实验和临床应用。此外，近年来，研究集中在RPE细胞中相关细胞因子的调控上[9-11]。

microRNAs(miRNAs)是真核细胞一类非编码的、稳定的、可调控的核糖核酸分子，可作用于其靶基因信使RNA(mRNA)3’端的非编码区碱基，引起mRNA降解或抑制mRNA翻译，参与到细胞进化、细胞增生、细胞凋亡、肿瘤和免疫反应等生物学过程中，调节人类三分之一基因的表达。miR-21作为一种致癌miRNA，在肿瘤领域尤其引人关注。miRNA-21通过对相关靶基因的调节参与多数肿瘤细胞凋亡、侵袭、增殖、转移及血管生成等过程，近年来miRNA在视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡中的研究逐渐增多[12]。有研究证明，miR-21在H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激损伤过程中异常表达[13]，因此本研究旨在探讨miRNA-21通过对Erk信号通路的影响，从而对视网膜色素上皮细胞的增殖和侵袭和凋亡的机制的研究。

资料与方法

一、材料

人视网膜色素上皮细胞系ARPE-9购自美国ATCC细胞库。miR-21 mimics，miR-21 inhibitors以及对照物由百奥迈科生物技术有限公司订购合成，鼠源β-actin单克隆抗体(艾博抗贸易有限公司)、兔源Erk单克隆抗体(密理博有限公司)、胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)、SYBR®Green Master Mix(诺唯赞生物科技有限公司)、高糖DMEM培养基(上海玉博生物科技有限公司)、胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司)、ECL发光液(碧云天生物技术有限公司)、Lipofectamine TM 3000试剂盒(美国Gibco公司)、FACSCanto流式细胞仪(美国BD公司)，二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(美国Cell Signal Technology)，二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠(美国Cell Signal Technology)。

二、方法

1.细胞培养与转染：ARPE-9细胞无菌培养于含10%的胎牛血清、1%的双抗的DMEM高糖培养基，37 ℃、5% CO2条件下培养以及传代。收集稳定传代细胞进行计数后接种，以每孔400 ×103个接种到细胞培养板上培养至细胞融合达到80%左右，更换为不含新生牛血清的DMEM高糖培养基，按照LipofectamineTM3000试剂盒操作说明书进行转染。将细胞分为4组：(1)空白对照组，(2)阴性对照组，(3)miR-21 mimics，(4)miR-21 inhibitors。每孔均加入1.5 μl Lipofectamine RNAiMAX，此外每组分别按空白对照不添加，阴性对照添加0.7 μl 20 μmol/l miR-21阴性对照物，miR-21 mimics添加0.7 μl 20umol/l miR-21 mimics，miR-21 inhibitors添加0.7 μl 20umol/L miR-21 inhibitors，每组设置6个重复。转染后进行常规培养48 h，收集各组细胞，供后续检测。

2.实时荧光定量PCR法检测miR-21，Erk基因的表达：各组收集细胞后，Trizol法提取总的RNA，之后取出1 μg RNA逆转录，Q-PCR法扩增cDNA片段，序列如下：miR-21上游5’ CGCATCGTTACCATCATCACG 3’，下游5’ TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT 3’， Erk上游5’ ATCCCAGTTCAATCGCCG 3’，下游5’ AATCACTGGCTTACGGCCTCCG3’，U6上游5’ ATTGGAACGATACAGAGAAGATT3’，下游5’ GAACGCTTCACGAATTTG3’。Q-PCR反应体系：Mix 10 μl，primer F 0.4 μl，primer R 0.4 μl，Rox 0.4 μl，CDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循环40次，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

3.Western Blot 检测Erk蛋白的表达：将细胞收集在1.5 ml离心管中，进行胰蛋白酶处理，以1200 rpm离心5 min，弃去上清液，用1 ml PBS洗涤两次，以1200 rpm离心min，然后弃去上清液，加入RIPA裂解液，涡旋，混匀，冰浴30 min，4 ℃，12000 rpm，离心15 min，将上清液转移至1.5 ml离心管中，用BCA法定量蛋白质。加入6×Lodding缓冲液，充分混合，并在100 ℃下煮沸5 min，以确保蛋白质变性。配置聚丙烯酰胺凝胶，根据定量结果，取50 μg样品，用80 V 待Marker分离，然后120 V直至溴酚蓝到达凝胶底部，以300 mA的恒定电流转移膜1.5 h，然后用5%脱脂奶的TBST封闭2 h，用兔单克隆抗体Erk(1：2000)，小鼠单克隆抗体β-actin(1：1000)4 ℃下过夜，然后用TBST洗涤3次，每次在摇床上5 min，二抗(1：3000)在室温下孵育1.5 h，用TBST洗涤3次，每次5 min，用ECl化学发光溶液显影，并用Tanon 4500自动化学发光图像分析仪扫描。

4.细胞增殖测定：将ARPE-9细胞以每孔5×104个细胞接种在24孔板(BIOFIL，加拿大)中，并按照LipofectamineTM3000试剂盒操作说明进行转染。 转染48 h后用Cell Titer 96 aQueous分析试剂盒(美国Promega)检测细胞增殖，MTS分析检测到72 h后细胞增殖。

5.Transwell侵袭测定：各组转染后的细胞作为单细胞悬浮液在无血清DMEM培养基中收获，并将150 ul细胞悬浮液(3×104个细胞)接种在上室(Corning，New York，USA)中。同时，下室为充满600 μl补充有10%FBS的DMEM培养基。对于侵袭测定，在将细胞接种到室中之前，将室用基质胶包裹6 h。37 ℃孵育12 h后，细胞用冰冷的甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色5 min。在200%结晶紫的显微镜下获取图像5 min，图像是细胞用冰球重复固定。

6.Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡：取对数生长期的细胞，按照分组接种于六孔板中，分别转染处理，到达时间后收集细胞，PBS 洗涤2 次，取3×105个细胞，加入195 μl 结合液重悬细胞，之后加入5 μl AnnexinV-FITC，混匀，常温避光孵育10 min，离心，弃上清。加入200 μl 结合液轻轻重悬细胞，加入20 μl PI混匀，将样品用锡纸包裹，1 h 内上流式细胞仪进行检测。

三、统计学分析

两组之间比较采用t检验，P<0.05表示有显著差异。 数据分析是通过GraphPad Prism5进行。

结 果

一、Q-PCR法检测miR-21基因，Erk基因的表达

结果如图1 ，miR-21 mimics 组与阴性对照组相比miR-21和Erk表达水平明显上调，miR-21 inhibitors 组与阴性对照组相比miR-21和Erk表达水平明显下调，而空白对照组和阴性对照组无明显差异，此结果具有统计学意义(P<0.01)，说明转染质粒成功实现miR-21，Erk表达水平的上调和下调。

图1 各组miR-21，Erk基因表达比例柱形图

二、Western法检测Erk蛋白的表达水平

结果如图2所示，miR-21 mimics 组与阴性对照组相比Erk蛋白表达水平明显上调，miR-21 inhibitors 组与阴性对照组相比Erk蛋白表达水平明显下调，而空白对照组和阴性对照组无明显差异，此结果具有统计学意义(P<0.01，P<0.001)。

图2 各处理组Erk蛋白表达水平(A)以及蛋白表达水平柱形图(B)

三、MTT法检测四组ARPE-9细胞的增殖能力

如图图 3，miR-21 mimics 组与阴性对照组相比细胞增殖能力明显上调， miR-21 inhibitors 组与阴性对照组相比细胞增殖能力明显下调，而空白对照组和阴性对照组无明显差异，此结果具有统计学意义，(P<0.001，P<0.01)。

图3 各处理组ARPE-9细胞增殖比例柱形图

四、transwell检测四组ARPE-9细胞的侵袭

如图4所示，miR-21 mimics 组与阴性对照组相比细胞侵袭能力明显上调， miR-21 inhibitors 组与阴性对照组相比细胞侵袭能力明显下调，而空白对照组和阴性对照组无明显差异，此结果具有统计学意义，(P<0.001)。

图4 四组细胞的侵袭情况

五、流式细胞仪检测细胞的凋亡

如图图5所示， miR-21 mimics 组与阴性对照组相比细胞凋亡水平明显下调， miR-21 inhibitors 组与阴性对照组相比细胞凋亡水平明显上调，而空白对照组和阴性对照组无明显差异，此结果具有统计学意义(P<0.001)。

图5 四组细胞的凋亡水平

讨 论

PVR是由视网膜脱离后增生的纤维化组织形成引起的并发症，可引起视力丧失或失明[14，15]。 在PVR中，RPE细胞显著促进视网膜上纤维组织的发育[16]，而miRNA广泛分布HT在角膜，视网膜和晶状体及其他眼组织细胞中，在正常的眼组织中表现出特异性表达。它在眼组织的生长发育，分化，损伤后的组织再生以及昼夜节律的调节中起重要作用。miRNA的突变或异常表达会影响正常组织细胞的生长、增殖、分化和凋亡并导致细胞恶性生长。Erk通路可参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等多种细胞生物学过程。

本研究首先通过质粒转染实现ARPE-9细胞中miR-21表达水平的改变，之后通过对细胞增殖，侵袭，凋亡水平的检测表明miR-21的上调促进细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，同时增加Erk蛋白的表达水平。

综上所述，我们的研究初步揭示miR-21通过Erk信号通路调节视网膜色素上皮细胞的增殖和侵袭和凋亡，相关机制需要进一步研究。