Stargardt病一家系致病基因突变位点的研究与分析付何云

郭光 王文玲 李才锐

Stargardt病又称Stargardt黄斑营养不良，全球发病率约为1/10000，多于青少年期发病，平均年龄为15.2岁[1，2]。该病在遗传性黄斑营养性疾病中较常见，检测显示多数为ABCA4 基因突变。该基因突变会造成由它编码的视杆细胞外节段表达的特异的ATP结合盒转运蛋白功能异常。该功能异常会造成视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium，RPE)积累全反式视黄醛，全反式视黄醛再转化为A2E，脂褐素的主要组成成分是A2E，脂褐素的毒性会损害RPE并且遮盖光感受器[3，4]。本研究对Stargardt病一家系致病基因突变位点进行筛查并分析。

资料与方法

一、一般资料

6名Stargardt病家庭成员(1，2患者，4基因携带者)。获得所有受检者知情同意后，由同一医生，在安阳市眼科医院对所有受检者进行至少一次检查。

二、方法

临床采集病史，裂隙灯显微检查，验光，应用1%的托吡卡胺滴眼液扩瞳后进行眼底检查，荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和频域相干光层析成像术(spectral domain optical coherence tomgography，SD-OCT)、视网膜电图(electroretinogram,ERG)检查。采集6名受检者外周血5 ml， EDTA抗凝管中封存，送北京康旭医学检验所行全外显子Slim检测，确定基因分型和突变。提取基因组DNA，构建基因组文库，测序。所有的研究都经过了安阳市眼科医院审查委员会的批准。

三、诊断依据

双眼中心视力进行性下降，配镜提高不明显或无法提高；黄斑区营养不良，牛眼征，家族性发病，基因检测。

结 果

一、基本资料

6例受检者中，2例患者。1例携带者，患者1，女性，年龄19岁；患者2，男性，10岁；携带者，女性，年龄43岁。家族系见图1，临床信息见表1。通过检查，发现6位受检者的眼前段和眼压基本正常。患者1双眼矫正视力0.3，患者2双眼矫正视力0.3。

图1 Stargardt家系图

表1 2例患者及1例携带者基本信息

随访半年，患者1视力基本稳定在矫正视力0.3。眼底彩照见图2A、B，SD-OCT图2C、D；患者2矫正视力较之前稍差，矫正0.2，患者眼底彩照见图3A、B，FFA图3C、D和SD-OCT图3E、F。检测到的黄斑中心凹结果可见异常。已发病者，视乳头边界清，视网膜血管正常，双眼黄斑部呈一类椭圆形的萎缩区，同时黄斑区色素紊乱。

图2 患者1眼底像及SD-OCT检查

图3 患者2眼底像及FFA和SD-OCT检查

二、DNA测序结果

患病者1、2和携带4者均检测到ABCA4基因异常.共检测到8个突变,见表2。检测出致病基因突变8处，ABCA4 基因c.1760+2T>G，USH2A 基因c.7068T>G和c.9340C>T，FZD4 基因c.205C>T，IMPDH1 基因c.1405+9A>G，PRIMPOL 基因c.265T>G，RB1 基因c.2212-9C>A，TSC2 基因c.856A>G。患者外祖母、外祖父和父亲无发病无突变。母亲含有3个突变，姐姐病情较弟弟轻，8个突变中含有4个，病情重的弟弟含有8个突变，姐弟两人前三个基因突变遗传均源于母亲。测序图见图4。(以下数据对应人类基因组GRCh37/hg19版本)：

表2 本研究中发现的突变基因的突变形式

图4 Stargardt病基因测序图

(1).ABCA4基因，转录本NM_000350， c.1760+2T>G，具体位置位于染色体chr1:94528666；

(2).USH2A 基因，转录本 (NM_206933)，c.7068T>G；具体位置位于染色体chr1:216138711；

(3).USH2A 基因，转录本 (NM_206933)，c.9340C>T；具体位置位于染色体chr1:216011364；

(4)FZD4 基因，转录本(NM_012193)，c.205C>T，具体位置位于染色体chr11:86665923；

(5)IMPDH1 基因，转录本(NM_000883)，c.1405+9A>G，具体位置位于染色体chr7:128035176；

(6)PRIMPOL 基因， 转录本(NM_152683)，c.265T>G，具体位置位于染色体chr4:185580578；

(7)RB1 基因，转录本(NM_000321)，c.2212-9C>A，具体位置位于染色体chr13:49039125；

(8)TSC2 基因，转录本(NM_000548)，c.856A>G，具体位置位于染色体chr16:2108755。

讨 论

Stargardt 病主要损害中心视力、视野，双眼黄斑区视网膜色素上皮层和神经上皮进行性萎缩，组织病理学改变可以发现RPE细胞层脂褐质沉积和感光细胞的丢失和死亡。95%以上的Stargardt 病与ABCA4基因(OMIM：601691；GenBank：NG_009073.1)的异常有关[5，6]。ABCA4基因位于染色体1p22，全长约8kb，含50个外显子，cDNA长度为6705bp，它编码2235个氨基酸，位于视网膜视杆细胞外段的视盘膜中。目前在ABCA4基因中，已发现约900种基因突变。在我国的大样本研究中，基因突变最多的为错义突变(55.1%)，其次为剪切突变(17.6%)，移码突变(15.4%)，无义突变(11.8%)[7]。同时，PRPH2、VMD2、ELOVL4和PROM1基因突变可以起部分Stargardt 病或者类似临Stargardt 病床表型的眼病[8]。

已知的Stargardt 病的致病基因，有些基因也会导致同一重叠的临床表型，例如，ABCA4 基因是 Stargardt 病 1 型、视锥杆细胞 营养不良 3 型、视网膜黄色斑点沉着、早发性严重视网膜营养不良、视网膜色素变性 19 型的致病基因，为常染色体隐性遗传方式(AR)。临床表型多样和致病基因复杂导致 Stargardt 病容易漏诊和误诊。临床检查和基因检测有效结合有利于诊断 Stargardt 病。

在国际上，Tomas R的研究中发现了ABCA4染色体上的W663X和A1038V基因的混和突变[9]，错义突变A1038V是Tomas R报道的新发“温和”突变。w663x的致病突变曾被报道[10]。ABCA4基因最常检测到的突变之一是杂合等位基因L541P/A1038V。当ABCA4染色体在体外时，缺乏L541P[11，12]，A1038V无法对ATP酶产生影响。G1961E的错义突变是ABCA4基因检测中最常见的突变，并被报道为温和表型[12-14]。本研究中两患者均为青少年，矫正视力在0.3左右，ABCA4基因考虑c.1760+2T>G突变为温和型。当然也不排除，随着年龄的增大，患者视力渐进性下降，临床上我们还要进一步随访和观察。

本研究中发现了8个基因突变，其中c.1760+2T>G位于，杂合变异，内含子Intron12，虽已经有文献曾报道Stargardt 病的该基因突变，但该突变未引起氨基酸变化，所以其致病性还有待进一步研究。c.7068T>G位于USH2A 基因，杂合变异，外显子Exon37，造成第2356号氨基酸由Asn变为Lys(p.Asn2356Lys)，为错义变异。c.9340C>T位于USH2A 基因，杂合变异，外显子Exon47，造成第3114号氨基酸由Pro变为Ser(p.Pro3114Ser)。USH2A 基因突变可造成视网膜色素变性，Usher综合征2A型(遗传性耳聋-视网膜色素变性综合征)。USH2A 基因的致病突变，目前汇报的有近800个，USH2A 基因含有72个外显子，编码5202个氨基酸。c.205C>T位于FZD4 基因，杂合变异，外显子Exon1，造成第69号氨基酸由His变为Tyr(p.His69Tyr)。FZD4 基因可引起渗出性玻璃体视网膜病变I型、早产儿视网膜病变。c.1405+9A>G位于IMPDH1 基因，杂合变异，内含子Intron13，未引起氨基酸变化。IMPDH1 基因可引起Leber先天性黑朦II型，视网膜色素变性10型。c.265T>G位于PRIMPOL 基因，杂合变异，外显子Exon4，造成第89号氨基酸由Tyr变为Asp(p.Tyr89Asp)。PRIMPOL 基因可引起近视。c.2212-9C>A位于RB1 基因，杂合变异，内含子Intron21，未引起氨基酸变化。RB1 基因可导致体细胞突变(膀胱癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤)。c.856A>G位于TSC2 基因，杂合变异，外显子Exon10，造成第286号氨基酸由Met变为Val(p.Met286Val)。TSC2 基因可导致体细胞突变(局部皮质发育不良、淋巴管平滑肌瘤病)，结节性硬化症2型。

本研究中两患者其母亲含有ABCA4基因和USH2A 基因中的3个突变，但是表型正常。患者1含有8个突变，患者2含有4个突变，考虑两患者Stargardt 病的发病可能是多基因作用的结果。Stargardt 病的致病基因除了常见的ABCA4基因突变，也不排除USH2A 基因、FZD4 基因、IMPDH1 基因、PRIMPOL 基因、RB1 基因、TSC2 基因，在以后的研究和临床诊治中，扩大考虑致病基因范围。本研究拓宽了Stargardt 病的研究范围，为新的领域的研究提供参考依据。

该病严重危害青少年视力，目前主要的治疗方法有营养补充治疗，高压氧治疗，尚在研究的基因治疗，细胞移植治疗，细胞因子治疗等。现在临床上还无有效控制该病进展的疗法，但是早期诊断可以给患者提供延缓视力损害的措施，比如减少阳光照射，佩戴墨镜，经常戴帽子等，低视力康复咨询、组织不必要的过量的维生素A的摄入。本研究为Stargardt 病的研究、为临床患者的遗传咨询、产前诊断等提供了提供了分子生物学参考依据。