结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在HIV合并肺结核人群中的诊断性能研究

闫 峰，孙雪娟

(长春市传染病医院,吉林 长春130062)

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的以特异性细胞免疫功能受损为主要特点的全身性疾病，因其免疫力低下，常常合并各种机会性感染，结核分枝杆菌(MTB)感染是其最常见的机会性感染[1-2]。 HIV阳性患者感染MTB后，结核病发病率较 HIV 阴性患者增加30倍[3-4]。据世界卫生组织提供数据显示，2017年HIV阳性患者因结核病死亡例数为30万例(26.6-33.5万)[5]。有文献报道，HIV合并结核病的患者临床结核中毒症状不明显，影像学表现也不典型，传统的检验方法如抗酸染色镜检、结核菌素试验、MTB细菌培养以及分子生物学检测等的准确性都较低[6]。本文旨在探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB) 在HIV合并结核病诊断中的应用价值，以期为临床准确、快速诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至2019年9月期间，长春市传染病医院收治的HIV阳性患者512例，其中依据中华人民共和国卫生行业标准(WS 288-2017)确诊或临床诊断为肺结核病患者195例，肺部其他疾病患者317例(对照组)，性别包括男419例，女93例；年龄13-79岁，年龄中位数41岁。分别收集入院抗结核治疗以及抗病毒治疗前(ART)第1次抽取的外周血进行T-SPOT.TB检测，以及痰液/体液样本进行病原学检测，对检测结果进行回顾性分析。

1.2 诊断标准

所有患者均在吉林省，长春市CDC确认为HIV抗体阳性，诊断标准符合2005年国家AIDS诊断标准[7]。

1.3 结核病诊断分组及标准

根据临床表现(发热、咳嗽、胸痛、呼吸困难等)、影像学表现(斑片、结节、纵隔淋巴结肿大等)以及病原学检测结果，病原学检测方法包括痰涂片、痰培养、分子生物学检测，其中任意一项结果阳性定义为病原学阳性，所有病原学结果均为阴性定义为病原学阴性。

1.4 主要试剂和仪器

T-SPOT.TB试剂盒(英国Immunotec公司)及配套仪器试剂。分子生物学检测试剂包括：①结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒(Gene-Xpert)[赛沛(上海)商贸有限公司]。②结核分枝杆菌复合群核酸(DNA)检测试剂盒(LAMP法)[荣研生物科技(中国)有限公司]。

1.5 方法

1.5.1T-SPOT.TB ①外周血样本处理 采用T-SPOT.TB试剂盒，检测分泌IFN- γ的T细胞，严格按照试剂说明书操作，常规分离外周血单个核细胞，用细胞培养基MD AIM-V将细胞悬起，计数后细胞浓度调至2.5×106个/ml。② T-SPOT.TB样本测定：在预先包被有抗γ-干扰素单抗的孔中加入0.1 ml的细胞悬液，每份样品设置4个检测孔，分别为阴性对照(无血清培养基)、阳性对照(植物血凝素)、抗A[主要成分为早期分泌抗原靶6(ESAT-6)]、抗B[主要成分为培养滤液蛋白10(CFP-10)]，各50 μl，样品加好后放入HF151UV CO2培养箱培养16-20 h，洗板，加显色液、终止液，判读结果。

1.5.2阳性结果判定标准 ①空白对照孔斑点数为0-5个时，且(抗原A或抗原B孔的斑点数)-(空白对照孔斑点数)≥6；②空白对照孔斑点数6-10个且(抗原A或抗原B孔的斑点数)≥2×(空白对照孔斑点数)。如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时，结果为“阴性”。

1.5.3结核菌涂片抗酸染色 采用结核菌染色液试剂盒(荧光金胺O法)，检查样本中结核分枝杆菌，严格按照操作说明书操作。

1.5.4结核菌培养 ①样本处理:取痰标本1-3 ml加入处理管中，加1-2倍体积4%NaOH溶液，旋涡震荡30-60 s，室温静置，并开始计时15 min。接种0.1 ml至培养基斜面，每份标本接种两支培养基，保持斜面水平向上，在培养箱37℃中培养24 h后将培养基竖直放置，继续培养。②结果判读:接种后第3天、第7天至以后每周观察1次并记录结果，如有菌落生长，则进行涂片镜检以鉴别污染菌，至第8周末仍无菌落生长，报告分枝杆菌培养阴性。

1.5.5LAMP法 ①样本测定:采用结核分枝杆菌复合群核酸(DNA)检测试剂盒定性检测样本中结核分枝杆菌复核群核酸(DNA)，采集含脓性部分的合适的痰标本40-60 μl，严格按照试剂说明书操作。②LAMP结果判读:在确认阳性对照发出绿色荧光，阴性对照没有发出荧光后对样本进行判读,阳性：发出绿色荧光，阴性：未发出荧光。

1.5.6Gene-Xpert检测 ①痰样本测试前处理:痰液中加入1-2倍体积4%NaOH,摇匀，室温静止30 min使样本液化，按样本处理试剂：样本(V∶V)2∶1的比例混合倒进50 ml带有螺旋盖子的前处理管中，用力震荡10-20次，室温下静置15 min。②结果判读:结核分枝杆菌检出高、结核分枝杆菌检出中、结核分枝杆菌检出低、结核分枝杆菌检出极低为阳性结果，结核分枝杆菌未检出为阴性结果。

1.6 统计学方法

采用Excel表建立数据库，由专人对数据进行提取并转入数据库。采用SPSS25.0统计软件对原始数据进行统计分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-SPOT.TB检测结果分析

195例确诊或临床诊断为HIV阳性合并肺结核的患者中，T-SPOT.TB检测阳性143例，敏感性为73.33%；317例HIV阳性肺部其它疾病患者中，T-SPOT.TB检测阴性275例，特异性为86.75%。见表1。

表1 HIV合并结核病患者T-SPOT.TB检测结果

2.2 T-SPOT.TB与分子生物学检测结果比较分析

进行分子生物学检测的样本包含42例Gene-Xpert检测样本以及56例LAMP检测样本，共计98例，其按照临床诊断结果分为肺结核组44例，肺部其它疾病组54例，将其与T-SPOT.TB的结果进行比较显示：T-SPOT.TB检测的敏感性77.27%(34/44) 高于分子生物学检测敏感性47.73%(21/44)，差异有统计学意义(χ2=8.194，P<0.05)。T-SPOT.TB检测特异性87.04%(47/54)与分子生物学检测特异性96.3%(52/54)无统计学差异(χ2=3.030，P>0.05)。两者联合检测，诊断HIV合并肺结核的敏感性为90.9%(40/44)，特异性为81.5%(44/54)。见表2。

表2 T-SPOT.TB与分子生物学检测结果比较分析

本研究肺部疾病对照组(317例)包含5例临床诊断为非结核分枝杆菌 (NTM)的患者，T-SPOT.TB在5例患者检测结果都是阴性，特异性100%(5/5)，提示在HIV人群利用T-SPOT.TB结果区分结核分枝杆菌感染与NTM感染可能存在一定的价值[8]。

采用受试者工作特征曲线(简称“ROC曲线”)分析诊断HIV合并结核的最佳界值，T-SPOT.TB检测的ROC曲线下面积是0.879，当取T-SPOT.TB在面积最大时ROC曲线拐点值5为界值时，诊断结核病的敏感度为83.1%(162/195)，特异性为84.5%(268/317)(图1)。

图1 T-SPOT.TB与病原学检测的受试者工作特征曲线

3 讨论

3.1 T-SPOT.TB在HIV人群合并结核病的诊断价值

结核分枝杆菌感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者最为常见的机会性感染，两者共感染可加速各自的疾病进程[9]。及时发现 HIV患者合并结核感染，对于 HIV感染合并结核病患者的有效治疗具有积极的意义。T-SPOT.TB是采用酶联免疫斑点技术，测定在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下受试者外周血样本中释放IFN-γ的效应T淋巴细胞数量，该方法在结核感染诊断中的价值已被越来越多的临床研究证实，敏感性可高达约90%[10-12]。但HIV患者属于免疫功能异常人群，T-SPOT.TB作为基于免疫学的检测方法检测性能可能受到影响，致使该检测方法诊断HIV合并结核病人群的结核灵敏度受到限制[13-14]。本研究结果显示，在HIV阳性肺结核人群中，T-SPOT检测的敏感性只有73.33%(143/195)，低于之前文献中的相关报道[15]。因此通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线，得出T-SPOT.TB在检测ROC曲线下面积是0.879，当T-SPOT.TB取5为界值时，诊断结核病的敏感性为83.1%，特异性为84.5%。

3.2 T-SPOT.TB与分子生物学检测方法在HIV合并肺结核人群检出性能分析

既往研究表明，与单纯肺结核相比，HIV合并肺结核患者痰抗酸杆菌阳性率更低，症状及影像学特征不显著，临床诊断更为困难[16-17]。近年来，结核分子生物学检测技术得到了快速发展，在涂阴培阳的人群里有很高的检出率，特别是以美国赛沛公司的Gene-Xpert以及日本荣岩的LAMP为代表，发表过国内外多篇相关文献。本文研究结果显示：T-SPOT.TB检测HIV合并肺结核的敏感性77.27%(34/44) 高于分子生物学检测敏感性47.73%(21/44)，差异有统计学意义(χ2=8.194，P<0.05)，如果将两者联合检测,可将HIV合并肺结核患者的临床检出率提高到90.9%(40/44)。

3.3 T-SPOT.TB在HIV阳性合并NTM感染人群诊断性能分析

NTM是艾滋病人中最常见的机会性感染病原体[18]。有研究表明，在痰培养分枝杆菌阳性人群中，艾滋病组NTM阳性率明显高于非 HIV感染组[19]。NTM抗酸染色结果、临床症状、X线表现与结核相似,难以鉴别,而且多数NTM对抗结核药物有天然耐药性,因此正确鉴定结核分枝杆菌和NTM对于疾病诊断和治疗至关重要。结核感染 T 细胞检测试剂盒(免疫斑点法)从结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型)中选择有用的抗原 ESAT-6 和CFP 10，两种抗原在卡介苗(BCG)和大多数NTM中都缺失，降低与 BCG和NTM的交叉反应，提高了特异性[20]。本研究在肺部疾病对照组中包含5例临床诊断为NTM的患者，T-SPOT.TB检测结果都是阴性，特异性100%(5/5)，提示在HIV阳性人群利用T-SPOT.TB进行结核病与NTM鉴别诊断可能存在一定的价值。

本研究仍存在一定不足。首先，大多数HIV阳性结核病患者难以获得MTB病原学阳性结果，诊断多依据临床表现、影像学表现及常规生化指标，尽管符合临床实际，但可能对T-SPOT.TB诊断性能的评估出现偏差；其次，本次入组的HIV合并NTM患者只有5例，因此利用T-SPOT.TB区分结核分枝杆菌感染与NTM感染的价值还需要进一步验证；再次，本研究取5为界值能否作为HIV合并结核人群临床诊断的参考依据，还需要大样本多中心的研究。

综上所述，结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在HIV人群诊断结核病有较高的敏感性和特异性，可作为HIV合并肺结核人群辅助诊断结核病的依据。