混样核酸检测联合酶免法筛查献血者乙肝病毒感染的残余风险分析

秦强国,张国平,李瑞丽

(焦作市中心血站 体采科,河南 焦作454000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是常见的携带性传染性疾病，主要传播途径是输血传播[1]。美国有220万人患有慢性乙型肝炎，我国是HBV高发地，对献血人群进行HBV检测尤为重要，目前输血安全已经成为全球关注的焦点[2]。近年来我国医疗检测技术进步飞速，在对HBV检测的准确率也不断提高，有效减少了输血传播的概率[3]。传统的HBV检测方法是酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)(简称酶免法)，利用HBV表面抗原进行检测，但是由于HBV存在窗口期、隐匿性HBV、病毒载量低等问题，使HBV酶免法检测存在一定缺陷，出现窗口期的HBV感染患者漏诊风险较大[4-5]。有研究表明[6]，2001年美国因献血者HBV窗口期导致HBV传播的流行率达0.0097%，且至2008年，HBV流行率并未下降。为进一步降低输血传播HBV病毒的风险，缩短通过输血传播HBV检测的窗口期，国家卫生行政主管部门要求2015年全国血站对献血者血液筛查实行核酸检测，全面推广核酸检测筛查。核酸检测，具有灵敏度高的特点，对血液混合检验，通量大，效率高，后续需要对有反应性的样本进行拆分检测，以确定反应性样本。在献血者血液筛查中，酶免法联合核酸检测可以降低血液HBV残余的风险[7]。本研究讨论酶免法及混样核酸检测法筛查献血者HBV感染，旨在了解献血者混样核酸检测联合酶免法筛查献血者HBV感染的残余风险。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1选取2016年1月-2019年12月焦作市中心血站无偿献血者182 525人，所有献血者献血前均已同意献血且献血者末梢血体检合格，献血者均符合国家《献血者健康检查要求》。

1.1.2182 525人献血者同步每人留取血液标本5 ml各3管：第1管肝素钠用于ELISA(初检)，第2管EDTA-K2 ELISA(复检)和第3管带分离胶EDTA-K2用于NAT检测。标本的采集、离心、运送、检测均严格按照《血站技术操作规程(2015)、(2019)版》执行。

1.2 仪器与试剂

1.2.1仪器

Uranus AE 200全自动酶免分析仪(深圳爱康公司)；Chitas BSS1200全自动核酸纯化仪(上海浩源生物科技有限公司)；ABI7500实时荧光定量PCR系统(美国ABI公司)；TDL5B台式大容量低温离心机(长沙英泰公司)。

1.2.2试剂

ALT试剂盒(上海荣盛)；HBsAg ELISA检测试剂(法国Bio-Rad公司和北京万泰)；抗-HCV ELISA检测试剂(北京万泰、珠海丽珠)；抗-HIV ELISA检测试剂(珠海丽珠、法国Bio-Rad)；抗-TP检测试剂(北京万泰和珠海丽珠)；HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA NAT试剂盒(PCR荧光法，上海浩源)。

1.3 方法

采用酶免法对HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP分别进行2遍测试，由不同检验人员使用不同试剂进行检测(不同厂家试剂)。同时用上海浩源核酸检测系统对酶免法检测阴性的血液样本进行核酸8人混检，若pool为无反应，核酸混检结果为NAT阴性；若pool为有反应，则需要进行拆分单检，拆分有反应性的标本判为NAT阳性。

1.4 酶免法检测结果判定

S/CO≥1(S表示样品OD值，CO表示cutoff值)，判定为阳性，S/CO≤0.7,判定为阴性即合格。0.7

1.5 NAT检测阳性献血者调查追踪

每隔1个月对HBV检测阳性献血者追踪检测1次，献血者每次到就近采血点留血液样本。每次采集3管，1支用酶免法检测，2支用于核酸检测，连续3次检测阴性为合格，任何1次或1项检测阳性为不合格。

1.6 统计学处理

唐山现代9.0软件中的统计模块进行资料整理，SPSS 20.0软件分析研究数据。

2 结果

2.1 182 525份标本酶免法及混样核酸联合检测结果不合格占比分析

2016年1月-2019年12月不合格1 493份，不合格率0.82%。2016年、2017年、2018年、2019年献血后标本各项检测不合格结果比例分别为1.03%、0.82%、0.75%、0.69%。见表1。

表1 2016-2019年献血后筛查不合格情况(n/%)

2.2 酶免法检测结果

182 525例献血者中，酶免法检测出1 144例不合格，不合格率0.63%(1 144/182 525)，见表2。

表2 献血者2016年1月-2019年12月酶免法检测结果

2.3 酶免法检测合格献血者核酸检测结果

在181 381例2遍酶免法检测合格的献血者中，核酸检测总不合格为167份，不合格率0.092%。核酸检测出HBV-DNA阳性155例，阳性率0.085%(155/181 381)，HCV-RNA阳性4例，阳性率0.002%(4/181 381)，HIV-RNA阳性8例，阳性率0.004%(8/181 381)，见表3。

表3 酶免法检测合格献血者核酸检测结果

2.4 追踪检测结果判定

对155例HBV-DNA核酸检测阳性的献血者中42例进行3次追踪检测发现，酶免法检测追踪显示有0例阳性，核酸检测追踪显示31例阳性，见表4。

表4 42例HBV-DNA核酸检测阳性3次追踪检测结果判定

3 讨论

HBV是一种通过血液传播的病毒性传染病，早期该病无明显的临床症状。我国是人口大国，HBV感染率呈增高趋势，对献血人群的血液筛查是减少HBV传播的重要措施[8]。献血者血液的质量安全决定着输血者的生命安全，一旦血液中携带HBV病毒未被检测出来，将导致输血者感染HBV，直接影响患者的生命及家庭安全[9]。但是HBV感染者，由于HBV存在窗口期及HBV的不稳定性，导致HBV有时难被检测出来，因此需要效率高，准确高的检测方法。酶免法检测HBV常用的传统方法，常以乙肝表面抗原HBsAg作为检测指标，在血液筛查中具有重要地位[10]。但是由于HBV感染者在窗口期、感染期皆存在隐匿感染，酶免法无法检测出来，献血者血液筛查中存在严重的HBV漏检现象，导致不少输血者感染HBV。有研究显示，酶免法检测献血者血清结果呈假阴性是导致输血者感染HBV的主要途径[11]。本研究发现，2016年1月-2019年12月182 525例献血者中酶免法检测HBV检测出432例不合格，不合格率0.24%，在181 381例2遍酶免法检测合格的献血者中,核酸检测出HBV-DNA阳性155例，不合格率0.085%,提示酶免法筛查献血者HBV风险可能具有漏检现象。朱丽敏研究发现[12]混样核酸检测法对HBV的诊断比酶免法具有更高的敏感度和特异度。

由于酶免法检测的局限性，对HBV DNA低载量的、处于窗口期感染或隐匿期感染的献血者血液样本无法检测出是否含HBV，这样输血者就暴露在感染HBV的极大风险中[13-14]。核酸检测技术可以缩短窗口期HBV检测，同时对隐匿性HBV检测具有较好的检测结果[15]。核酸检测技术已经被应用于美国、日本、英国等20多个国家，作为对献血者血液筛查是否存在HBV的检测[16]。周磊等[17]研究报告混样核酸检测筛查献血者HBV感染发现有141份标本存在HBV感染风险，拆分后的核酸标本再次检测发现有4份存在HBV感染，说明混样核酸检测与拆分核酸筛检对于降低输血感染HBV残余风险具有重要作用，但仍需慎重对待需要重检的血液样本，防止漏检，提高血液的安全性。余占娟等[7]研究发现混样核酸检测可有效的降低HBV输血感染的残余风险，为输血安全提供有效的保证。本研究发现在183 181例2遍酶免法检测合格的献血者中，核酸检测总不合格为167份，不合率0.09%。提示混样核酸检测筛查献血者HBV感染，可能会降低筛查献血者感染HBV的残余风险。155例HBV-DNA核酸检测阳性中42例3次追踪检测发现，酶免法检测追踪显示有0例阳性，核酸检测追踪显示有31例阳性，可能是HBV基因发生了突变，核酸检测阳性献血者HBV隐匿性感染比例增加，也增加了输血传播HBV的残余风险[18]。

综上所述，混样核酸检测可以弥补酶免法的缺陷，应用混样核酸检测联合酶免法可以大幅度降低筛查献血者HBV感染的残余风险，但本研究追踪调查样本数量较少和追踪时间较短，需进一步加大样本追踪量，延长追踪检测周期，以降低输血传播HBV的残余风险。