AKT1基因多态性与中国汉族人群双相情感障碍遗传易感性的关系探讨

闻庆云，周香云，吴远雄

(阜阳市第三人民医院 精神科,安徽 阜阳236000)

双相情感障碍(bipolar disorder，BPD)是一种兼有轻躁狂或躁狂、抑郁发作的心境障碍，目前通常认为环境因素、遗传因素与其发病密切相关[1]。有学者发现[2]，哺乳动物大脑中葡萄糖代谢受损和线粒体功能障碍是导致BPD发病的直接因素，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1-a)的信号传导途径可能在该病发生、发展中具有重要作用。近年来研究指出[3-4]，AKT1基因多态性与精神病发作的年龄相关，且可影响利培酮治疗精神分裂症的疗效，但关于其遗传位点多态性与BPD发病关联的报道尚少。本研究选取110例BPD患者，分析AKT1基因多态性与其遗传易感性的关系，为BPD的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月-2020年10月阜阳市第三人民医院收治的110例BPD患者，设为BPD组。纳入标准：(1)符合中华医学会精神科分会发布的《CCMD-3中国精神障碍分类与诊断标准》中BPD诊断标准[5]，经2位(或以上)副主任医师以上职称的精神科医师确诊；(2)自我或其直系亲属报告显示均属中国汉族血缘；(3)受试者之间不存在血缘关系。排除标准：(1)各种躯体疾病或脑器质性疾病导致的精神障碍；(2)药物治疗导致的精神障碍；(3)精神发育迟滞；(4)合并严重躯体性疾病；(5)合并癫痫、脑卒中等神经系统疾病；(6)妊娠期、哺乳期患者。另选取同期于阜阳市第三人民医院进行体检的110例健康受试者，设为健康组。纳入标准：(1)精神正常的健康人；(2)自我或其直系亲属报告显示均属中国汉族血缘。排除标准：(1)精神疾病家族史；(2)神经系统疾病病史、家族史；(3)家族性遗传病史；(4)妊娠期、哺乳期妇女。本研究开展前已获取医院伦理委员会审批，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1酚-氯仿法提取DNA[6]采集BPD组及健康组空腹肘部静脉血5 ml，加入抗凝管，静置分层后3 000 r/min，离心半径12 cm离心15 min，收集上层血浆待用；取抗凝血0.5 ml，混合等量RIPA细胞裂解液，8 000 r/min，离心半径8 cm离心10 min取沉淀，加入酚-氯仿混合液250 μl充分混匀，离心取上清液与等体积氯仿溶液混合，再次离心取上清，加入无水乙醇充分混匀，离心后弃上清，重复无水乙醇操作，室温风干，保存于-20℃备用。采用紫外分光光度计鉴定DNA浓度，确保各DNA样本浓度基本保持一致。

1.2.2单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点选取 本研究AKT1基因的全序列由Pubmed核酸数据库提供。AKT1基因位于14q32，全长26 395 bp。选取5个SNP位点rs2494732、rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358作为BPD中AKT1基因多态性的研究位点。

1.2.3聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)检测基因多态性[7]从美国国家生物技术信息中心下载AKT1基因标准序列，采用引物设计软件primer 5.0设计引物，检测5个AKT1基因SNP rs2494732、rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358多态性的引物序列,见表1。采用PCR扩增试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)及TP700实时荧光定量聚合酶链反应仪(日本宝生物工程株式会社)扩增目的片段，设置反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸60 s，重复40个循环，72℃延伸10 min，获取PCR产物。设置RELP反应体系，DNA模板100 ng，dNTP 1 μM，上、下游引物各0.5 μM，Taq聚合酶10 U，Buffer缓冲液10倍稀释，dd H2O补充至25 μl。取20 μl PCR产物采用Ampli Taq DNA聚合酶荧光标记测序试剂盒(美国ABI公司)进行纯度及内引物扩增，并采用该公司PRISM 377-96 DNA自动测试仪分析PCR产物序列，经Chromas软件鉴定基因型。由2人分别进行判读，重新检测结果不一致的样本，基因分型成功率100%。

表1 AKT1基因多态性的引物序列

1.3 统计学方法

独立样本t检验；采用Logistic回归分析法分析AKT1基因rs3730358多态性与BPD遗传易感性关系，计算影响因素比值比(odds ratio，OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般人口学资料

对BPD组和健康组的性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)分别进行χ2检验与t检验，结果显示两组间均无显著差异(P>0.05)，表明两组性别、年龄、BMI相匹配，来自于同一群体,见表2。

表2 本研究所纳入两组受试者的基本信息与性别、年龄、BMI匹配情况

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

采用拟合优度χ2检验分析无血缘关系的BPD组与健康组，5个AKT1基因多态性位点中，除rs2494732外(χ2=13.240，P<0.001)，rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358位点基因型频率实际值与理论值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，表明本研究所选样本可代表一般人群。

2.3 BPD组与健康组rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358基因多态性

BPD组与健康组rs3730358基因型等级分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)；BPD组rs3730358 T等位基因频率高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)；BPD组与健康组rs3001371、rs3803300、rs2498799基因型等级分布及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 BPD组与健康组rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358基因多态性比较[例(%)]

2.4 AKT1基因rs3730358多态性与BPD遗传易感性关系

经Logistic回归分析，AKT1基因rs3730358位点C/C、C/T、T/T基因型及C、T等位基因可能是BPD遗传易感性影响因素(P<0.05),见表4。

表4 AKT1基因rs3730358多态性与BPD遗传易感性关系

3 讨论

BPD是威胁人类健康的功能性精神障碍疾病，以较高的复发率为主要特征，且病程迁延。在当前社会压力逐渐增加的背景下，BPD患者数量持续增加，自杀率与犯罪率也随之上升，影响社会安定[8]。目前BPD治疗以锂盐、卡马西平等心境稳定剂为核心治疗药物，短期疗效显著，但仍面临着易复发、易致残等问题，加之患者自控能力差、精神状态异常、习惯发生改变、出现抵触行为，治疗难度进一步增加。有关BPD的病因学研究一直是医学界热点。调查资料显示[9]，BPD存在明显的家族聚集现象。同时，经典双生子实验也说明遗传是BPD发病的重要原因，多条染色体区域或候选基因与其发病有关[10-11]。当BPD相关基因发生遗传突变时，对应氨基酸将发生改变，且可能会对编码蛋白质的结构造成影响，导致其功能丧失。此外，BPD具有表型异质性，其临床表现多种多样，而不同表型可能存在不同的分子遗传学机制。因此，根据基因多态性探寻与BPD发生有关的遗传易感性基因具有广阔的前景。

AKT是一种高保守性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其作为PI3K信号通路下游关键效应分子，具有维持细胞稳态、促细胞增殖、拮抗凋亡等生理功能[12]。活化的PI3K在细胞膜上生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)，进而与AKT结构域结合，诱使AKT转移至细胞膜上，磷酸化后进入胞浆与细胞核中，发挥对应的生物学效应。肿瘤、糖尿病、精神分裂症等疾病中可见PI3K/AKT信号通路异常，该通路过度激活可能是肿瘤发生及耐药性产生的机制之一[13-15]。然而在精神类疾病中，PI3K/AKT信号通路受到明显抑制，导致中枢神经元及海马干细胞功能降低，从而诱发精神疾病如BPD发生。Jia等[16]研究显示，3种抗双极性药物锂盐、卡马西平、丙戊酸可通过调节原代培养星形胶质细胞中PI3K/AKT信号通路增加糖原含量，从而改善疾病症状。此外，有研究表明[17]，因精神疾病自杀患者的脑组织中，AKT表达明显降低，采用抗精神病药物处理围绝经期抑郁样大鼠后，AKT表达明显上调，且进一步上调其表达可显著增强抗精神病药物疗效。目前关于AKT1基因多态性与BPD遗传易感性的研究尚少，本研究选取AKT1-rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358多态性位点发现，BPD组与健康组rs3730358基因型等级分布比较，差异有统计学意义，BPD组rs3730358 T等位基因频率高于健康组，且经Logistic回归分析，rs3730358位点C/C、C/T、T/T基因型及C、T等位基因可能是BPD遗传易感性影响因素，提示AKT1-rs3730358位点携带T等位基因者与BPD遗传易感性关系密切，推测与rs3730358位点突变及神经递质的合成、释放有关，进而增加BPD易感性风险，然而关于该位点的文献尚少，关于其具体功能仍需大量的后续实验进一步证实。

综上所述，AKT1-rs3730358位点基因多态性与中国汉族人群BPD遗传易感性关系密切。目前有报道并不支持AKT1是BPD的候选基因，例如Millischer等[18]人在瑞典BD患者中的报道指出，对全基因组关联数据的分析未发现BPD与AKT1区域之间存在任何关联，表明AKT1是否是BPD的候选基因仍存在争议，本研究结果与其存在较大差异。BPD在不同区域、种族人群中存在遗传上的异质性，且其发生是多个不同基因的积累作用，而实际上单个基因所发挥的作用很小，同时BPD发生受到环境因素的影响。因此，即便证实某基因与BPD具有关联性，也并不代表BPD的病因已被明确，尚需要寻找更大的样本量，并进行多个位点SNP研究。